半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）雌魚分子細胞遺傳學分析.pdf

1、本研究對半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)雌魚進行了分子細胞遺傳學分析，主要包括：半滑舌鰨雌魚基因組結(jié)構(gòu)特征分析、fosmid文庫克隆的染色體熒光原位雜交分析、半滑舌鰨W染色體的激光顯微切割及擴增、W染色體文庫的構(gòu)建及分析、半滑舌鰨雌魚特異片段的獲得及分析等。同時，要實現(xiàn)半滑舌鰨的全雌育種，有兩個技術(shù)問題需要解決：(1)、如何區(qū)分ZZ和ZW，即如何鑒別雌魚和雄魚，從而篩選出性逆轉(zhuǎn)的偽雄魚；(2)、如何區(qū)分ZW和WW

2、，即如何篩選出超雌魚。本研究建立了雙引物PCR法并獲得了雌魚特異性FISH探針，分別解決了這兩個難題。主要結(jié)果如下： 1.半滑舌鰨雌魚基因組結(jié)構(gòu)特征分析本研究利用流式細胞術(shù)對半滑舌鰨、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、石鰈(Kareius bicoloratus)和圓斑星鰈(Verasper variegates)的基因組大小進行了測定并進行了比較，檢測結(jié)果為：半滑舌鰨雄魚基因組大小為586.80 Mb，雌

3、魚基因組大小為606.36 Mb。同時我們發(fā)現(xiàn)無法利用流式細胞儀通過檢測紅血細胞的DNA含量的方法來鑒別半滑舌鰨的雄魚和雌魚。 隨機挑取1,152個半滑舌鰨雌魚fosmid文庫克隆進行雙末端測序，獲得2，247條序列。序列總長1,921，341 bp，大約占半滑舌鰨雌魚基因組的3.17‰。對這些序列進行如下分析：首先利用Tandem Repeats Finder(TRF)軟件進行串聯(lián)重復序列的查找，結(jié)果共得到889條重復序列，其

4、中微衛(wèi)星序列303條，小衛(wèi)星序列586條，分別占串聯(lián)重復序列總數(shù)的34.09％和65.91％，沒有找到衛(wèi)星序列。從長度上看，所有串聯(lián)重復序列總長105，307 bp，其中微衛(wèi)星序列19，363 bp，小衛(wèi)星序列85，944 bp，分別占串聯(lián)重復序列總長的18.39％和81.61％，占測序總長的1.01％和4.47％。 其次，通過在線服務器RepeatMasker查找，共獲得38條散布重復序列，總長4,983 bp，占測序總長的0

5、.26％。查找到的散布重復序列共有4種類型：DNA轉(zhuǎn)座子、LTR反轉(zhuǎn)座子、LINE反轉(zhuǎn)座子和SINE反轉(zhuǎn)座子。與散布重復的其它類型相比，DNA轉(zhuǎn)座子在數(shù)目和長度上均占有絕對優(yōu)勢。 2.半滑舌鰨雌魚fosmid克隆的染色體定位分析根據(jù)對fosmid克隆兩端序列的分析及BLAST比對結(jié)果，我們選擇了8個克隆進行FISH定位。其中5個克隆含有單拷貝基因，有4個克隆獲得了穩(wěn)定又清晰的單一信號，另外1個克隆的信號出現(xiàn)在了幾乎所有的染色體上

6、。余下的3個克隆均含有rRNA基因序列，我們嘗試對它們進行染色體定位，結(jié)果有2個克隆在W染色體和3對常染色體上出現(xiàn)陽性信號，而另1個克隆只在1對常染色體上出現(xiàn)雜交信號。以上FISH雜交結(jié)果將有利于半滑舌鰨細胞遺傳學研究，比如基因的染色體定位，性染色體的進化，染色體重排等工作的開展。 3.半滑舌鰨雌魚W染色體的顯微分離及W染色體文庫的構(gòu)建和分析利用Leica LMD激光顯微切割系統(tǒng)對半滑舌鰨W染色體的顯微切割進行了探索，成功地將W

7、染色體顯微分離，進行了DOP-PCR擴增，并將PCR擴增產(chǎn)物定位在了W染色體和Z染色體上。同時利用W染色體的擴增產(chǎn)物構(gòu)建了半滑舌鰨的w染色體文庫，共獲得了596個克隆。從中選取288個克隆測序，得到了259條序列。對這些序列進行了串聯(lián)重復、散布重復及BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有52條串聯(lián)重復序列，2條散布重復序列。其中串聯(lián)重復序列中有12條微衛(wèi)星序列，40條小衛(wèi)星序列；而2條散布重復序列全部都是DNA轉(zhuǎn)座子類型。值得一提的是，我們發(fā)

8、現(xiàn)有9個克隆均含有一段幾乎完全相同的近540 bp的序列，從而推斷半滑舌鰨的性染色體可能含有大量的多拷貝重復序列。 4.半滑舌鰨性別相關(guān)片段的獲得及分析對W染色體文庫克隆的序列進行引物設計，利用5條雌魚和5條雄魚的DNA為模板進行PCR篩選，共獲得2對半滑舌鰨雌魚的特異性引物，加上1對陽性對照引物，我們建立了雙引物PCR法，該方法可以非常準確迅速地區(qū)分半滑舌鰨的雌魚和雄魚。同時利用這2對特異性引物對半滑舌鰨雌魚fosmid文庫的