腫瘤干細(xì)胞在NSCLC細(xì)胞EMT介導(dǎo)的EGFR-TKI獲得性耐藥中的作用.pdf

1、癌癥的發(fā)病率和死亡率在我國(guó)日益凸顯，癌癥位居我國(guó)死因之首。探索EGFR-TKIs獲得性耐藥新機(jī)制，積極尋求逆轉(zhuǎn)耐藥的新方法將具重要的臨床意義。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞失去上皮表型，獲得間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)特性的一種生物學(xué)現(xiàn)象，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞變得梭長(zhǎng)、細(xì)胞間連接變得疏松，分子水平上表現(xiàn)為其E-鈣黏蛋白、角蛋白等上皮標(biāo)記蛋白表達(dá)下調(diào)，波形蛋白、N-鈣黏蛋白、纖維連接素等間質(zhì)標(biāo)記基因表達(dá)升高。
　　目的:
　

2、　探討CSC生成與EMT介導(dǎo)的NSCLC EGFR-TKIs獲得性耐藥的關(guān)系，從而為提高EGFR-TKIs療效探尋新靶點(diǎn)和新方法。
　　方法:
　　1、EMT在PC-9/AB吉非替尼獲得性耐藥中的作用:我們首先選用EGFR基因19號(hào)外顯子突變型人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9，經(jīng)吉非替尼誘導(dǎo)成獲得性耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9/AB，觀察PC-9/AB是否出現(xiàn)EMT，其次我們通過轉(zhuǎn)染CDH1基因高表達(dá)E-cadherin逆轉(zhuǎn)EMT后獲得P

3、C-9/AB-CDH1，PC-9用TGF-β1誘導(dǎo)PC-9發(fā)生EMT后獲得PC-9/TGF-β1。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及westernblotting實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)各細(xì)胞株EMT情況。
　　2、篩查CSC特異性表面標(biāo)記分子:我們首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞株CD44與CD133的表達(dá)情況。確定兩標(biāo)記分子在各細(xì)胞株中均有表達(dá)后，我們采用MACS(magnetic-activated cell sorting)法將細(xì)胞株分選為CD44+、C

4、D44-、CD133+及CD133-四群細(xì)胞。
　　3、PC-9與PC-9/AB兩細(xì)胞株CSC含量對(duì)比:確定CSC表面標(biāo)記物后，我們隨即采用成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)PC-9及PC-9/AB兩細(xì)胞株的體外成球能力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC-9及PC-9/AB兩細(xì)胞株的側(cè)群細(xì)胞含量，采用流式細(xì)胞術(shù)（根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記CD44及CD133）來檢測(cè)PC-9及PC-9/AB兩細(xì)胞株CD133+/CD44+細(xì)胞含量，從而聯(lián)合對(duì)PC-9及PC-9/AB兩細(xì)胞株

5、的CSC含量進(jìn)行量化對(duì)比。
　　4、PC-9/AB與PC-9/AB-CDH1兩細(xì)胞株CSC含量對(duì)比:我們首先予PC-9/AB轉(zhuǎn)染CDH1基因獲得PC-9/AB-CDH1。通過CCK8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞株對(duì)EGFR-TKI（吉非替尼）敏感性，并通過形態(tài)學(xué)變化及western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞株EMT情況，最后通過成球?qū)嶒?yàn)、流式細(xì)胞術(shù)來對(duì)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞株的CSC含量進(jìn)行量化對(duì)比，從而反向驗(yàn)證CSC是否與EMT介導(dǎo)的N

6、SCLCEGFR-TKI獲得性耐藥有關(guān)。
　　5、PC-9與PC-9/TGF-β1兩細(xì)胞株CSC含量對(duì)比:用TGF-β1誘導(dǎo)PC-9獲得PC-9/TGF-β1，通過CCK8法檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞株對(duì)EGFR-TKI（吉非替尼）的敏感性，并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及western blotting實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞株EMT情況，最后通過成球?qū)嶒?yàn)、流式細(xì)胞術(shù)來對(duì)誘導(dǎo)前后細(xì)胞株的CSC含量進(jìn)行量化對(duì)比，從而正向驗(yàn)證CSC是否與EMT介導(dǎo)的NS

7、CLC EGFR-TKI獲得性耐藥有關(guān)。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用Graphpad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、EMT介導(dǎo)PC-9/AB吉非替尼獲得性耐藥與親代PC-9相比，耐藥后PC-9/AB對(duì)吉非替尼敏感性下降，IC50分別為（0.07±0.04）μM與（10.85±2.64）μM(P＜0.01

8、);與前期研究類似，吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞PC-9/AB發(fā)生EMT改變，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)細(xì)胞梭形，細(xì)胞連接疏松，免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)PC-9/AB上皮型蛋白E-cadherin減少，而間質(zhì)型蛋白Vimentin表達(dá)增加。基因檢測(cè)顯示PC-9/AB無T790M突變及MET擴(kuò)增。對(duì)PC-9/AB轉(zhuǎn)染CDH1后高表達(dá)E-cadherin可逆轉(zhuǎn)EMT，PC-9/AB-CDH1對(duì)吉非替尼敏感性部分恢復(fù)，IC50為（1.31±0.47）μM（P＜0.05）;

9、用TGF-β1誘導(dǎo)PC-9發(fā)生EMT后PC-9/TGF-β1對(duì)吉非替尼敏感性下降，IC50為（6.73±2.19）μM（P＜0.01）。
　　2、CD133可作為PC-9系列肺癌細(xì)胞的CSC標(biāo)記物根據(jù)既往研究，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞常選用CD44與CD133作為CSC標(biāo)記分子。為此，我們首先檢測(cè)PC-9系列細(xì)胞株CD44與CD133的表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)顯示CD133、CD44在各細(xì)胞株中均有表達(dá)，其中CD133+細(xì)胞在PC-9、PC-

10、9/AB、PC-9/AB-CDH與PC-9/TGF-β1細(xì)胞株中所占百分比分別為0.11％、1.2％、0.26％與0.75％，CD44+細(xì)胞所占百分比則分別為94.1％、97.6％、95.5％與98.4％。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CD44及CD133是否可作為CSC表面標(biāo)記分子，我們先用MACS細(xì)胞分選法將PC-9/AB細(xì)胞分為CD133+、CD133-、CD44+、CD44-四群細(xì)胞，然后利用流式細(xì)胞術(shù)、體外成球?qū)嶒?yàn)及體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)聯(lián)合給與驗(yàn)證。

11、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MACS分選法具有極高分選效率，從PC-9/AB分選出的CD133+細(xì)胞純度第1天可達(dá)96.6％;分選培養(yǎng)兩周后再分別對(duì)CD133-及CD133+細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，細(xì)胞出現(xiàn)分化，CD133+細(xì)胞可產(chǎn)生CD133+/CD133-細(xì)胞，CD133+細(xì)胞比例下降至15.8％，而CD133-只能產(chǎn)生CD133-細(xì)胞。體外成球?qū)嶒?yàn)顯示CD133+細(xì)胞成球能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CD133-細(xì)胞，成球數(shù)分別為（452±10.60）和（4.67

12、±0.88），P＜0.000。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示CD133+細(xì)胞成瘤能力顯著強(qiáng)于CD133-細(xì)胞，前者只需103細(xì)胞即可成瘤，后者106細(xì)胞也未能成瘤。以上結(jié)果均提示，CD133+細(xì)胞具有極強(qiáng)的自我更新分化能力，CD133可作為PC-9系列細(xì)胞的CSC標(biāo)記物。同理，我們也對(duì)CD44+/CD44-細(xì)胞進(jìn)行了干細(xì)胞特性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:MACS分選的CD44+細(xì)胞純度高達(dá)94.2％;分選出CD44-細(xì)胞與CD44+細(xì)胞，培養(yǎng)兩周后均可產(chǎn)生C

13、D44-與CD44+細(xì)胞;CD44+細(xì)胞與CD44-細(xì)胞的體外成球數(shù)分別為（76±12）和(63±15)，P=0.446; CD44+細(xì)胞和CD44-細(xì)胞體內(nèi)成瘤最低細(xì)胞數(shù)均為105個(gè)，成瘤速度與成瘤體積相當(dāng)。綜上，CD133+細(xì)胞具有顯著的CSC特性，CD133可作為PC-9系列細(xì)胞株CSC表面標(biāo)記分子。
　　3、PC-9/AB細(xì)胞株發(fā)生EMT改變伴隨著CSC含量增加我們隨即對(duì)PC-9及PC-9/AB的CSC含量進(jìn)行量化對(duì)比。流

14、式細(xì)胞術(shù)顯示:PC-9/AB細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞含量明顯高于PC-9細(xì)胞株，百分比分別為（1.20％±0.22％）與（0.11％±0.02％），P=0.008。側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)顯示:PC-9/AB細(xì)胞株中側(cè)群細(xì)胞比例明顯高于PC-9，百分比分別為（1.32％±0.24％）與（0.14％±0.03％），P=0.008。腫瘤成球?qū)嶒?yàn)顯示:PC-9/AB細(xì)胞株的成球能力顯著強(qiáng)于PC-9，成球數(shù)分別為（71±9.5）與（18±4.5），P=0.

15、007。
　　4、逆轉(zhuǎn)EMT后PC-9/AB細(xì)胞株中CSC含量降低對(duì)EMT逆轉(zhuǎn)后的PC-9/AB-CDH1進(jìn)行CSC檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)顯示:PC-9/AB-CDH1細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞含量較PC-9/AB顯著減低，百分比分別為（0.26％±0.05％）和（1.20％±0.22％），P=0.014。側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)顯示:PC-9/AB-CDH1細(xì)胞株中側(cè)群細(xì)胞比例明顯低于PC-9/AB，百分比分別為（0.34％±0.10％）和（1.3

16、2％±0.24％），P=0.019。腫瘤成球?qū)嶒?yàn)顯示:PC-9/AB-CDH1細(xì)胞株的成球能力較PC-9/AB有所減弱，成球數(shù)分別為（23±6.1）和（71±9.5），P=0.013。
　　5、TGF-β1誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞發(fā)生EMT后伴隨著CSC含量增加經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)兩周后，PC-9/TGF-β1細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞含量較PC-9顯著增高，百分比分別為（0.75％±0.14％）和（0.11％±0.02％），P=0.01。側(cè)

17、群細(xì)胞檢測(cè)顯示:PC-9/TGF-β細(xì)胞株中側(cè)群細(xì)胞比例明顯高于PC-9，百分比分別為（0.96％±0.22％）和（0.14％±0.03％），P=0.022。腫瘤成球?qū)嶒?yàn)顯示:PC-9/TGF-β細(xì)胞株的成球能力較PC-9顯著增強(qiáng)，成球數(shù)分別為(60±11.27)和（18±4.5），P=0.026。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn):NSCLC細(xì)胞在產(chǎn)生EGFR-TKIs耐藥的過程中出現(xiàn)了EMT，這些細(xì)胞株均無T790M突變及ME