李斯特菌感染的巨噬細胞來源的微顆粒在樹突狀細胞介導的獲得性免疫中的作用.pdf

1、【目的】天然免疫和獲得性免疫之間的相互作用在選擇性清除病原體的過程中發(fā)揮著重要的作用。機體感染病原菌后天然免疫細胞首先發(fā)揮作用,當天然免疫不能夠徹底清除病菌時,獲得性免疫隨之產(chǎn)生。巨噬細胞和樹突狀細胞這兩種關(guān)鍵的免疫細胞,對于天然免疫向獲得性免疫的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要,然而兩者間的作用機制尚不清楚。以李斯特菌感染模型為例,機體產(chǎn)生抗李斯特菌的獲得性免疫反應(yīng)必須需要樹突狀細胞的參與,單獨的巨噬細胞是不能夠誘導出抗李斯特菌特異性免疫的。然而樹突狀細

2、胞攝取李斯特菌的能力較巨噬細胞弱很多,這種對李斯特菌攝取能力的差異提示在細菌抗原加工、提呈并引起T細胞保護性免疫反應(yīng)的過程中,巨噬細胞和樹突狀細胞可能承擔著不同的職責和作用,了解兩者之間的作用途徑和機制尤為重要。近年來研究證明,微顆粒在細胞與細胞之間信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用,然而其在獲得性免疫過程中的作用尚不清楚。本研究證明了樹突狀細胞介導的抗李斯特菌特異性免疫過程中巨噬細胞的重要性,進一步驗證李斯特菌感染的巨噬細胞來源的微顆粒在樹

3、突狀細胞介導的T細胞免疫反應(yīng)中的作用,闡述巨噬細胞與樹突狀細胞間相互作用的新途徑。
　　【方法】
　　1.檢測巨噬細胞在誘導抗李斯特菌獲得性免疫中的作用
　　(1)清除體內(nèi)巨噬細胞,檢測過繼T細胞增殖實驗
　　選擇16g的雌性裸小鼠腹腔注射30μg抗F4/80的清除抗體,0.8mgClodrolip,或PBS。每組6只,注射體積為200μl,注射時間在Lm注射前48h和6h。將Lm感染過或未感染的BABL/c小鼠

4、的脾臟T細胞磁珠分選出來,CFSE染色后通過尾靜脈過繼接種給處理過的裸小鼠,5×106個T細胞/只。6h后將1×103個活Lm經(jīng)尾靜脈注入裸小鼠體內(nèi),60h后取裸小鼠脾臟細胞流式檢測過繼T細胞的增殖情況。
　　(2)體外實驗檢測巨噬細胞在李斯特菌刺激T細胞增殖過程中的作用
　　將BABL/c小鼠骨髓來源的DCs與Lm共培養(yǎng),加或不加腹腔巨噬細胞,培養(yǎng)時間分別為6h,12h,18h。再與Lm感染小鼠的脾臟T細胞按1:10共培養(yǎng)

5、,72h后加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷,18h后收集細胞,液體閃爍儀計數(shù)。
　　(3)體外實驗檢測李斯特菌感染的巨噬細胞上清對T細胞增殖的影響
　　用Lm感染的巨噬細胞上清或Lm的培養(yǎng)上清與骨髓來源的DCs共培養(yǎng),6h后再加入Lm感染小鼠的脾臟T細胞,72h后加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷,18h后收集細胞,液體閃爍儀計數(shù)。
　　2.李斯特菌感染的巨噬細胞釋放的微顆粒的檢測
　　(1)微顆粒的提取
　　巨噬細胞與

6、Lm共培養(yǎng)(補加100μg/ml的慶大霉素),培養(yǎng)12h后將上清液經(jīng)過多步離心除去細胞、細胞碎片和大部分細菌,再用1.0μm的濾膜將上清液過濾完全除去Lm,最后用14000g離心60min,獲得微顆粒沉淀。
　　(2)微顆粒的標記
　　用經(jīng)過CFSE染色的Lm感染巨噬細胞,收集上清液中的微顆粒,流式檢測?；蛘呤菍FSE染色的Lm與PKH-26染色的巨噬細胞共培養(yǎng),提取的微顆粒用雙光子共聚焦顯微鏡觀察。
　　3.李斯特

7、菌感染的巨噬細胞釋放的微顆粒的功能檢測
　　(1)Lm感染的巨噬細胞來源的微顆粒刺激DCs活化的檢測
　　將DCs分別與Lm感染的巨噬細胞微顆粒,巨噬細胞微顆粒和PBS共培養(yǎng),24h后分別用抗體CD80、CD86和MHCII的流式抗體染色,流式檢測表達情況。分時間段收取與微顆粒共培養(yǎng)的DCs蛋白樣品,Westernblot檢測DCs活化信號ERK和IκB的磷酸化水平。
　　(2)Lm感染的巨噬細胞來源的微顆粒刺激T細胞

8、增殖實驗
　　將不同數(shù)量級的Lm與巨噬細胞共培養(yǎng),提取的微顆粒再與DCs共培養(yǎng)后加入Lm感染小鼠的脾臟T細胞,72h后加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷,18h后收集細胞,液體閃爍儀計數(shù)。
　　4.動物實驗
　　選擇6-8周齡的BABL/c小鼠,每組6只,用Lm感染的巨噬細胞微顆粒皮下免疫小鼠,對照為正常巨噬細胞微顆?；騆m培養(yǎng)上清提取物免疫組。連續(xù)免疫7天后尾靜脈注射1×105活的Lm,連續(xù)10天觀察小鼠生存情況。
　

9、　【結(jié)果】
　　1.體內(nèi)實驗證明巨噬細胞參與DCs誘導的抗Lm獲得性免疫反應(yīng)
　　清除體內(nèi)巨噬細胞的裸小鼠過繼接種Lm感染小鼠的CFSE-T細胞,6h后尾靜脈注射活的Lm,60h后檢測發(fā)現(xiàn)清除了巨噬細胞組的小鼠脾臟中過繼T細胞不發(fā)生增殖。將Lm感染的巨噬細胞注射到C57BL/6小鼠腹腔,7天后分離出脾臟細胞經(jīng)過滅活的Lm再刺激,發(fā)現(xiàn)接種了感染的巨噬細胞組的脾臟細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-22的表達均顯著升高,同樣流式檢測

10、CD11c+細胞IL-12的表達上調(diào),CD4+細胞IFN-γ表達上調(diào)。這些結(jié)果說明誘導抗LmT細胞免疫反應(yīng)需要巨噬細胞的參與。
　　2.體外實驗證明Lm感染的巨噬細胞培養(yǎng)上清誘導DCs成熟并提呈抗原
　　分別用Lm感染的巨噬細胞培養(yǎng)上清,正常巨噬細胞培養(yǎng)上清和Lm的培養(yǎng)上清來培養(yǎng)DCs,24h后檢測DCs表面CD80、CD86和MHCII的表達,發(fā)現(xiàn)Lm感染的巨噬細胞組DCs這三者表達均上調(diào),表明DCs被激活。進一步通過T細

11、胞增殖實驗證明,Lm感染的巨噬細胞培養(yǎng)上清具有較強的刺激T細胞增殖的能力,提示Lm感染的巨噬細胞培養(yǎng)上清含有某種形式的Lm抗原,樹突狀細胞可以將其攝取并將抗原提呈給T細胞,誘導獲得性免疫反應(yīng)。
　　3.Lm感染的巨噬細胞來源的微顆粒刺激DCs活化
　　將Lm感染的巨噬細胞微顆粒提取出來,利用流式和雙光子共聚焦顯微鏡檢測,可以發(fā)現(xiàn)微顆粒中Lm成分的存在。通過流式檢測DCs表面CD80、CD86和MHCII的表達,Western

12、Blot檢測ERK和IκB的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)含有Lm成分的微顆?？梢源碳Cs活化并成熟,說明微顆粒將其含有的Lm抗原傳遞給DCs。
　　4.體外實驗證明DCs攝取微顆粒并提呈Lm抗原的機制
　　將Lm感染的巨噬細胞微顆粒與DCs共培養(yǎng),檢測DCs對微顆粒的攝取發(fā)現(xiàn)約有35％的DCs攝取了微顆粒。與正常情況下巨噬細胞釋放的微顆粒相比,Lm感染的巨噬細胞釋放的微顆粒表面Annexin-V表達更高,這可能是DCs更容易攝取含有Lm

13、成分微顆粒的原因。為了了解DCs是通過何種抗原提呈途徑提呈Lm抗原給T細胞的,我們用Lm感染MHC-I-/-小鼠巨噬細胞,提取的微顆粒再與DCs和CD8+T細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)T細胞增殖能力減弱,提示DCs攝取微顆粒中的Lm抗原后可以直接將MHC-I抗原肽復合物表達在細胞表面,提成給CD8+T細胞。而用MHC-II-/-小鼠的DCs與Lm感染的巨噬細胞微顆粒共培養(yǎng),檢測其對CD4+T細胞增殖的影響。我們發(fā)現(xiàn)T細胞增殖能力顯著降低,這一結(jié)果說

14、明DCs通過攝取微顆粒獲得Lm抗原,加工后組合成MHC-II-/-抗原肽復合物表達在細胞表面,再提成給CD4+T細胞。上述結(jié)果說明DCs可以通過多種方式攝取微顆粒,包括DCs與微顆粒間的細胞膜融合方式以及攝取后加工再提呈方式。而進一步利用MyD88-/-小鼠實驗證明,DCs攝取Lm-MPs這一過程與TLR信號通路無關(guān)。
　　5.體外證明含Lm成分微顆粒的產(chǎn)生受到細胞骨架變化的影響
　　利用F-actin聚合抑制劑和肌球蛋白I

15、I的ATP酶抑制劑作用Lm感染的巨噬細胞,發(fā)現(xiàn)含有Lm成分的微顆粒產(chǎn)量減少。這一結(jié)果提示肌球蛋白II的觸發(fā)和肌動蛋白絲產(chǎn)生的張力的變化都對巨噬細胞釋放Lm微顆粒具有重要的作用。
　　6.體內(nèi)實驗證明李斯特菌感染的巨噬細胞釋放的微顆粒被DCs攝取
　　將1×107個CFSE標記的Lm注射到小鼠腹腔,12h后沖洗腹腔收集微顆粒,大約有13%的微顆粒含有Lm成分,而這種Lm-MPs主要是由腹腔巨噬細胞釋放的,因為清除了巨噬細胞后,

16、含Lm成分的微顆粒比例下降到0.6%。將腹腔巨噬細胞釋放的Lm-MPs再注射到新小鼠腹腔,6h后收集腹腔細胞染色CD11c,流式檢測發(fā)現(xiàn)約有3%-6%的細胞CD11c+,而這些CD11c+細胞中有40%的細胞攝取了Lm-MPs。此結(jié)果說明體內(nèi)感染Lm后巨噬細胞將其吞噬再以Lm-MPs的形式釋放,DCs通過攝取Lm-MPs來獲得Lm的抗原。
　　7.Lm感染的巨噬細胞來源的微顆粒可以誘導抗Lm獲得性免疫反應(yīng)
　　分別用巨噬細胞

17、微顆粒和Lm感染的巨噬細胞微顆粒皮下免疫小鼠,Lm培養(yǎng)上清按提取微顆粒步驟處理后作為對照組,7天后尾靜脈注射1×105個活Lm于小鼠體內(nèi)。觀察各組小鼠成活情況,發(fā)現(xiàn)Lm感染的巨噬細胞微顆粒免疫的小鼠生存率顯著高于巨噬細胞微顆粒免疫小鼠和對照組小鼠。說明李斯特菌感染的巨噬細胞來源的微顆粒可以誘導抗李斯特菌保護性免疫反應(yīng)。
　　【結(jié)論】
　　本研究證明誘導抗李斯特菌獲得性免疫反應(yīng)需要巨噬細胞的參與。巨噬細胞吞噬李斯特菌后釋放出含