EMT在非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，已經(jīng)成為癌癥病人死亡的最常見原因。近年來，分子靶向治療成為研究熱點(diǎn)并運(yùn)用于臨床，以吉非替尼為代表的表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)已經(jīng)用于EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變型晚期

2、NSCLC的一線、二線治療，對(duì)EGFR野生型NSCLC的有效率也達(dá)到5％-6％[1]，然而耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)成為制約EGFR-TKIs進(jìn)一步應(yīng)用的瓶頸，使使用EGFR-TKIs治療的患者的中位無進(jìn)展時(shí)間僅為8～10個(gè)月[2]。因此，研究和發(fā)現(xiàn)EGFR-TKIs獲得性耐藥機(jī)制，積極尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的新方法具重要的臨床意義。
　　本課題組的前期研究已證實(shí)，EGFR野生型的NSCLC細(xì)胞H460在EGFR-TKIs獲得性耐藥過程中發(fā)生了EMT，

3、提示EMT可能在EGFR野生型NSCLC獲得性耐藥過程中起重要作用[9]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymaltransi ion，EMT)，是上皮細(xì)胞失去上皮特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的一種生物現(xiàn)象，發(fā)生EMT后，細(xì)胞E-鈣黏蛋白、角蛋白等上皮標(biāo)記基因表達(dá)降低，波形蛋白、纖維連接素、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標(biāo)記基因表達(dá)升高。EMT與腫瘤細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、藥物耐藥有密切關(guān)系[10,11]，且與NSCLC的預(yù)后[12]

4、及對(duì)EGFR-TKIs敏感性密切相關(guān)[13-16]。
　　與基礎(chǔ)研究結(jié)果一致，E-cadherin表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)NSCLC患者對(duì)EGFR-TKIs臨床療效的一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)記。一項(xiàng)觀察EGFR-TKIs聯(lián)合化療治療NSCLC的國(guó)際多中心隨即Ⅲ期臨床研究結(jié)果顯示:E-cadherin表達(dá)陽性的患者疾病進(jìn)展時(shí)間明顯延長(zhǎng)[23]。吉非替尼一線治療NSCLC，E-cadherin表達(dá)陽性的患者總生存顯著長(zhǎng)于E-cadherin表達(dá)陰性

5、的患者[24]。
　　多種轉(zhuǎn)錄因子密切參與了EMT的發(fā)生，目前發(fā)現(xiàn)Snail、Slug、Twist、ZEB1、Smad、NF-B等[25]。研究發(fā)現(xiàn)，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(ZEB1、slug)在吉非替尼獲得性耐藥的過程中也起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用，靶向消除Slug的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株的間質(zhì)化特征，恢復(fù)耐藥細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性[26]。對(duì)于NSCLC細(xì)胞發(fā)生EMT后EGFR-TKIs治療敏感性下降的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制目前尚未闡明。

6、>　　因此，在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，本課題擬通過構(gòu)建靶向CDH1基因的過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體感染EGFR野生型和突變型NSCLC細(xì)胞，提高E-cadherin的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的EMT，觀察耐藥細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性變化，探討EMT在NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs產(chǎn)生獲得性耐藥中的作用及其可能的分子學(xué)機(jī)制，為提高EGFR-TKIs療效尋找新靶點(diǎn)和新方法。
　　方法：
　　1、選用EGFR突變型的人肺腺癌細(xì)胞P

7、C/9及其吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/AB。高分辨率溶解曲線分析技術(shù)(Quantitative PCR high-resolutionmelting，qPCR-HRM)檢測(cè)PC9/AB細(xì)胞EGFR及Kras基因突變;MTT法檢測(cè)兩組組細(xì)胞的增殖情況;劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的改變; Western blot方法檢測(cè)兩組細(xì)胞的EGFR、p-EGFR、E-cadherin、Vimentin、Snai l等的蛋白水平

8、的表達(dá)變化。
　　2、利用GV218質(zhì)粒構(gòu)建靶向CDH1（NM-004360）（E-cadherin基因）的過表達(dá)載體和陰性對(duì)照載體，并用PCR電泳鑒定和基因測(cè)序;經(jīng)過鑒定測(cè)序的構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用Western Blot外源篩選有效過表達(dá)載體;選擇轉(zhuǎn)染效果良好的慢病毒載體進(jìn)行包裝并測(cè)定滴度。
　　結(jié)果：
　　1、PC9/AB細(xì)胞和H460/ER細(xì)胞的EGFR和K-ras基因突變狀況
　　基因突變

9、檢測(cè)結(jié)果顯示，PC9/AB細(xì)胞為EGFR基因19號(hào)外顯子缺失突變型及K-ras基因野生型，無T790M突變及cMET基因擴(kuò)增。前期研究結(jié)果顯示，H460/ER細(xì)胞為EGFR基因及K-ras基因野生型。
　　2、PC9/AB細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs敏感性下降
　　MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，PC9、PC9/AB細(xì)胞均呈無限繁殖。PC9/AB細(xì)胞對(duì)吉非替尼的增殖作用顯示為濃度依賴性作用，PC9/AB細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性較PC9細(xì)胞顯

10、著下降，IC50值分別為7.23±6.89μ mol/L和0.04±0.00μ mol/L(P＜0.05)。該結(jié)果說明，PC9/AB細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs產(chǎn)生了獲得性耐藥。
　　3、PC9/AB細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化
　　PC9/AB的細(xì)胞形態(tài)改變與PC9細(xì)胞相比，PC-9/AB細(xì)胞形態(tài)傾向梭形發(fā)展，細(xì)胞間連接變得更加疏松，符合間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。
　　4、PC9/AB細(xì)胞的遷移及侵襲能力變化劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC9/AB

11、劃痕兩邊緣距離均明顯縮短。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC9/AB穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯高于原親本細(xì)胞。
　　5、PC9/AB的EMT相關(guān)分子和EGFR在蛋白表達(dá)的變化
　　western blot結(jié)果顯示，vimentin、snail的蛋白表達(dá)水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。EGFR、E-cadherin、β-catenin的蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，PC9

12、細(xì)胞發(fā)生獲得性耐藥后，發(fā)生了EMT，且EGFR及其磷酸化蛋白表達(dá)降低。
　　6、CDH1基因慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建
　　針對(duì)CDH1基因成功構(gòu)建了2條過表達(dá)慢病毒載體LV-CDH1(5386-1)-P1、LV-CDH1(5386-1)-P2以及陰性對(duì)照載體CON136; q-PCR法外源篩選出有效過表達(dá)慢病毒載體LV-CDH1(5386-1)并進(jìn)行病毒包裝，獲得了較高滴度的慢病毒顆粒;感染結(jié)果顯示該慢病毒載體能穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)染H

13、460/ER和PC9/AB細(xì)胞。Q-PCR方法Western blot結(jié)果表明LV-CDH1(5386-1)慢病毒對(duì)H460/ER細(xì)胞的CDH1基因的mRNA水平提升了約16倍，蛋白表達(dá)水平明顯升高，LV-CDH1(5386-1)慢病毒對(duì)PC9/AB細(xì)胞的CDH1基因的mRNA水平提升了約4倍，蛋白表達(dá)水平明顯升高。
　　7、高表達(dá)E-cadherin后的H460/ER和PC9/AB細(xì)胞形態(tài)變化
　　與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，PC

14、9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細(xì)胞形態(tài)傾向橢圓形發(fā)展，細(xì)胞間連接變得緊密，符合上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。
　　8、高表達(dá)E-cadherin后細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化
　　劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細(xì)胞的劃痕兩邊緣距離均明顯增寬。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照細(xì)胞穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯高于PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細(xì)胞。以上結(jié)果

15、表明，高表達(dá)E-cadherin后，PC-9/AB和H460/ER細(xì)胞的細(xì)胞侵襲和遷移能力均明顯降低。
　　9、高表達(dá)E-cadherin后細(xì)胞EMT相關(guān)分子的蛋白水平變化
　　與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細(xì)胞的vimentin、snail的蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;E-cadherin、β-catenin的蛋白表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

16、0.05)。以上結(jié)果表明，高表達(dá)E-cadherin后，細(xì)胞發(fā)生了去EMT的變化。
　　10、高表達(dá)E-cadherin后細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性變化
　　MTT結(jié)果顯示，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細(xì)胞均呈無限繁殖。吉非替尼(0.01～10μmol/L)可抑制PC-9/AB-CDH1細(xì)胞生長(zhǎng)，該抑制作用呈濃度依賴性;PC9/AB-CDH1與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，對(duì)吉非替尼的敏感性增加約11.4倍，I

17、C50值分別為(0.70±0.22)μmol/L和(8.68±0.44)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。厄洛替尼(10～100μmol/L)可抑制H460/ER-CDH1細(xì)胞生長(zhǎng)，該抑制作用呈濃度依賴性;H460/ER-CDH1與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，對(duì)厄洛替尼的敏感度增加約6.1倍，IC50值分別為(7.51±1.12)μmol/L和(53.72±12.95)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　11

18、、高表達(dá)E-cadherin后細(xì)胞EGFR基因蛋白水平上的變化
　　western blot結(jié)果顯示，EGFR、p-EGFR蛋白表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn):
　　NSCLC細(xì)胞在產(chǎn)生EGFR-TKIs耐藥的過程中出現(xiàn)了EMT。逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的EMT可提高NSCLC對(duì)EGFR-TKIs的敏感性，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在NSCLC對(duì)EGFR-TKIs的獲得性耐藥中起重要作用