FBW7參與的非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥實驗研究.pdf

1、目的：
　　FBW7（F-box and WD repeat domain-containing7，F(xiàn)BW7）是F-box蛋白家族成員，為SCF型泛素連接酶復(fù)合物中識別底物的蛋白分子，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的泛素化降解。FBW7是一個抑癌蛋白，通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、周期和凋亡相關(guān)蛋白的降解參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的眾多生物學(xué)過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FBW7在Gefitinib敏感的親本細(xì)胞和相應(yīng)的耐藥細(xì)胞中存在差異性表達(dá)，細(xì)胞耐藥后FB

2、W7表達(dá)減少。我們將通過以下方案研究FBW7調(diào)控Gefitinib敏感性的分子機制，并探討以FBW7為靶點逆轉(zhuǎn)Gefitinib耐藥的研究策略。
　　方法：
　　1、Gefitinib從10 nM開始處理PC-9親本細(xì)胞，每2周加倍Gefitinib濃度，連續(xù)培養(yǎng)6個月獲得耐藥細(xì)胞PC-9GR，EGFR基因測序和FISH檢測PC-9GR是否出現(xiàn)T790M和Met擴增；2、通過PCR和Western blot方法比較親本細(xì)胞與

3、耐藥細(xì)胞FBW7在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況；3、通過shRNA下調(diào)親本細(xì)胞PC-9和HCC827 FBW7表達(dá)，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)Gefitinib耐藥性；4、明確FBW7調(diào)控Gefitinib敏感性的分子機制，探究Bcl-2家族抗凋亡蛋白Mcl-1在該過程中的作用。
　　結(jié)果：
　　1、MTT實驗證實PC-9GR對Gefitinib耐藥，基因測序和FISH未發(fā)現(xiàn)T790M與Met基因擴增；2、親本細(xì)胞FBW7在mRNA

4、和蛋白質(zhì)兩個表達(dá)水平均高于相應(yīng)耐藥細(xì)胞；3、shRNA慢病毒感染親本細(xì)胞，PCR和Western blot驗證FBW7下調(diào)效率，MTT、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等功能學(xué)實驗證實親本細(xì)胞在FBW7表達(dá)下調(diào)后對Gefitinib敏感性降低，細(xì)胞出現(xiàn)耐藥表型；4、親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞Bcl-2家族蛋白存在差異性表達(dá)，其中Mcl-1的差異最顯著。FBW7通過降解抗凋亡蛋白Mcl-1和調(diào)控Mcl-1半衰期t1/2影響細(xì)胞對Gefitin

5、ib敏感性。
　　結(jié)論：
　　1、FBW7在PC-9和HCC827親本細(xì)胞表達(dá)量高于耐藥細(xì)胞PC-9GR和HCC827GR5、HCC827GR6，并且PC-9GR不存在已知的耐藥機制T790M與Met擴增，提示FBW7表達(dá)下調(diào)可能是Gefitinib耐藥的一個新機制；2、下調(diào)親本細(xì)胞FBW7表達(dá)，PC-9和HCC827對Gefitinib敏感性降低，Gefitinib IC50增加且細(xì)胞凋亡比例降低，推測下調(diào)FBW7表達(dá)可能