?；切苋パ跄懰釋?duì)NIH3T3細(xì)胞成骨分化和礦化的影響研究.pdf

1、異位骨化（Ectopic ossification），是一種在非骨化組織中生成板層狀骨或鈣化復(fù)合物的一種病理狀態(tài)，其發(fā)生機(jī)制目前并不完全明確。從組織形態(tài)學(xué)分析，形成的這些異位骨與正常胚胎時(shí)期骨的形成和骨折后骨的再生類(lèi)似，在性質(zhì)上屬于軟骨內(nèi)骨或膜內(nèi)骨。目前，臨床中應(yīng)用最多的兩種預(yù)防和治療方式是放射療法和吲哚美辛藥物治療，但這兩種治療方式存在嚴(yán)重的副作用，因此，更有效安全的治療方法急待發(fā)現(xiàn)。
　　研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)能夠在成骨分化

2、和骨形成中發(fā)生并激活信號(hào)通路：PERK/eIF2α/ATF4，IRE1/XBP1s和ATF6介導(dǎo)的信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)Perk-/-和ATF4-/-小鼠觀察發(fā)現(xiàn)，這些小鼠中存在嚴(yán)重的骨發(fā)育缺陷，主要是因?yàn)樗鼈兊某晒欠只芤种?，重要的骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子無(wú)法正常表達(dá)，蛋白分泌途徑受損，不能有效地表達(dá)、加工和分泌膠原蛋白、骨鈣素和骨涎蛋白等骨基質(zhì)成分。在IRE1α-/-敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）中，同樣出現(xiàn)骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)降低，成骨分化能

3、力及胞外骨基質(zhì)蛋白（如骨鈣素，骨涎蛋白，骨橋蛋白等）表達(dá)受抑制的現(xiàn)象。雖然在 ATF6-/-小鼠中沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的骨發(fā)育異常癥狀，但在 S1P-/-（ATF6的修飾酶之一）敲除小鼠中，成熟的Ⅱ型膠原表達(dá)嚴(yán)重下降，導(dǎo)致軟骨發(fā)育異常和軟骨內(nèi)骨形成受抑制。
　　?；切苋パ跄懰?Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)，廣泛存在于人和動(dòng)物的膽汁中，是一種親水膽汁酸衍生物，具有保護(hù)肝細(xì)胞，拮抗疏水性膽汁酸的細(xì)胞毒作用

4、，促進(jìn)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，在人體血液中的正常濃度范圍是0.4-4μM。研究表明，TUDCA能夠加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊的能力，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ER Stress）。TUDCA已經(jīng)廣泛用于治療膽石癥，膽汁淤積性肝病等疾病，其作用機(jī)理就是抑制ER Stress反應(yīng)，從而對(duì)疾病起到一定的抑制作用。在最近的報(bào)道中，Cai等人分析，在兔和鼠主動(dòng)脈瓣（AV）鈣化模型中，?；切苋パ跄懰嵬ㄟ^(guò)對(duì)ER Stress的抑制作用，可減弱AV成骨細(xì)胞分化，顯著防止

5、主動(dòng)脈瓣（AV）鈣化，通過(guò)體外研究證明，TUDCA通過(guò)抑制ER Stress，能抑制氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）誘導(dǎo)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（VICS）向成骨細(xì)胞分化。
　　鑒于以上，我們提出假設(shè)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER Stress）也許參與異位骨化的發(fā)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典抑制劑?；切苋パ跄懰幔═UDCA）也許能夠通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)來(lái)抑制異位骨化現(xiàn)象。因此，如果假設(shè)成立，?；切苋パ跄懰釋?duì)異位骨化相關(guān)疾病的治療和預(yù)防將發(fā)揮其巨大潛力。

6、　　因此，在本研究中，我們用含3mM無(wú)機(jī)磷酸鹽（Na3 PO4, Pi）的成骨培養(yǎng)液來(lái)誘導(dǎo)NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為異位骨化的體外模型。選擇不同濃度的TUDCA（0.1，1，5，10μM）干預(yù)成骨誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞的成骨分化和礦化，通過(guò)對(duì)NIH3T3礦化表型分析，探究TUDCA對(duì)異位礦化的影響。通過(guò)Western-Blot驗(yàn)證了TUDCA干預(yù)作用下，對(duì)無(wú)機(jī)磷酸鹽（Na3 PO4，Pi）誘導(dǎo)的異位礦化模型中ER Stress激

7、活的三條信號(hào)通路中相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)的影響。同時(shí)，成骨分化相關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)也通過(guò)Western-Blot進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　第一章 TUDCA對(duì) NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成骨分化和和礦化的影響
　　目的：檢測(cè)TUDCA對(duì)NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成骨分化和和礦化的影響。
　　方法：用不同濃度的TUDCA作用于成骨誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，pNPP法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶

8、活性，茜素紅染色和定量檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)的生成情況，鄰甲酚酞絡(luò)合酮法測(cè)定鈣離子沉積情況，RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)礦化標(biāo)記基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：TUDCA劑量依賴(lài)性抑制成骨誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞的增殖，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性，礦化結(jié)節(jié)的生成，鈣離子沉積和相關(guān)礦化標(biāo)記基因的表達(dá)。
　　結(jié)論：小分子TUDCA能夠劑量依賴(lài)性抑制無(wú)機(jī)磷酸鹽（Na3PO4，Pi）誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞的增殖及成骨分化和礦化作用。
　　第二章TUDCA通過(guò)

9、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)抑制NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成骨分化和和礦化
　　目的：檢測(cè)TUDCA是否通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)來(lái)抑制NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成骨分化和和礦化。
　　方法：Western-Blot法檢測(cè)無(wú)機(jī)磷酸鹽對(duì)ER Stress的激活情況，并檢測(cè)TUDCA干預(yù)作用下成骨誘導(dǎo)的 NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成骨分化和和礦化的中 ER Stress反應(yīng)活化的相關(guān)信號(hào)通路中重要信號(hào)分子的表達(dá)情況。
　　結(jié)