siRNA抑制STGC3基因表達(dá)對NIH3T3細(xì)胞生長增殖的影響.pdf

1、目的：STGC3基因是新近克隆的一個候選抑瘤基因。本研究以STGC3基因陽性表達(dá)的鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞為模型，采用siRNA技術(shù)，使NIH3T3細(xì)胞的STGC3基因表達(dá)下調(diào)，觀察STGC3基因表達(dá)下調(diào)對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響。 方法：構(gòu)建針對STGC3基因 mRNA的pSilencer3.1-STGC3-siRNA表達(dá)載體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，G418篩選，建立穩(wěn)定的pSilencer 3.1- S

2、TGC3-siRNA/NIH3T3細(xì)胞系。RT-PCR、Western blotting和免疫細(xì)胞化學(xué)方法，檢測STGC3基因mRNA和蛋白表達(dá)。通過HE染色、繪制生長曲線、軟瓊脂集落形成實驗及流式細(xì)胞儀分析，觀察STGC3基因表達(dá)下調(diào)后，NIH3T3細(xì)胞形態(tài)、增殖速度、克隆形成率和細(xì)胞周期分布變化。 結(jié)果：重組質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切和測序鑒定，結(jié)果均證實pSilencer3.1-STGC3-siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。將pSilen

3、cer3.1-STGC3-siRNA和pSilencer3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，G418篩選陽性細(xì)胞克隆，經(jīng)RT-PCR、Western blotting及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測結(jié)果表明，成功建立了STGC3基因表達(dá)下調(diào)的NIH3T3細(xì)胞系。普通光學(xué)顯微鏡下觀察，pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3細(xì)胞與兩對照組相比，核染色加深，細(xì)胞變得細(xì)長；細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示：pSilencer3.1-STGC3

4、-siRNA/NIH3T3細(xì)胞較pSilencer3.1/NIH3T3細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞生長速度快；軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果證實， pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3組、pSilencer3.1/NIH3T3組和NIH3T3組克隆形成率分別為(6.4±1.0)％、(2.2±0.3)％和(2.1±0.3)％, pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3組克隆形成能力較兩對照組顯著增強；流式

5、細(xì)胞儀檢測結(jié)果：pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3組較對照組細(xì)胞群體中處于S期和G2的細(xì)胞數(shù)目增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)目減少。 結(jié)論： 1．構(gòu)建了pSilencer3.1-STGC3-siRNA真核表達(dá)載體。 2．建立了STGC3基因表達(dá)下調(diào)的pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3細(xì)胞系。 3．siRNA抑制STGC3基因表達(dá)可促進NIH3T3細(xì)胞增殖。