殼聚糖對轉染人骨形成蛋白2基因的NIH3T3細胞相容性研究.pdf

1、牙周病是人類最常見的口腔疾病之一，也是導致成人失牙的最主要的原因。牙周治療理想的目標就在于誘導牙周組織再生，重建新生的牙周膜、牙槽骨和牙骨質，恢復牙周組織的結構和功能。目前牙周病的治療尚不能從根本上實現這一目標。組織工程是一個以細胞生物學、發(fā)育生物學和生物材料學為基礎，采用發(fā)育的方法，以新組織替代損傷組織的新興科學領域。隨著組織工程向牙周相關領域滲透，給牙周病的治療開辟了新的思路。 組織工程的三大要素是：具有增殖分化潛能的種子細

2、胞、細胞外基質材料、生長因子的作用。如何將種子細胞復合生長因子后植入細胞外基質材料，實現三者有效地統一，發(fā)揮功能是當前研究較多的內容。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)是最常用的應用于誘導牙周組織再生的生長因子。如采用基因工程的方法，將BMP基因導入種子細胞，置于細胞外基質替代材料(即支架)后植入牙周骨缺損部位，使之在局部分泌BMP生長因子，可有效地實現牙周組織再生的目標。 支架材料是種子

3、細胞的生長土壤，現在組織工程學者關注的是天然支架的開發(fā)。殼聚糖是從甲殼類動物外殼中提取出來的直鏈純天然多糖，也是自然界唯一具有弱陽離子型電解質的新型生物醫(yī)用材料。殼聚糖結構中含有與細胞外基質主要成分糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)共有的N-乙酰葡聚胺組分。殼聚糖容易被溶菌酶降解，具有廣譜抗菌性，其良好的塑形性及可加工性，可被加工成任意形狀。殼聚糖有良好的成膜性，成膜后具有很好的均一性和較高的機械強度，具有成為一種支

4、架的可能性。但將轉基因細胞與殼聚糖等生物材料復合，國內外研究甚少。本實驗將轉染hBMP2基因的NIH3T3細胞接種殼聚糖膜支架，采用細胞生長增殖實驗、成骨活性測定等檢測轉基因細胞與殼聚糖的生物相容性，初步探察其在牙周組織工程的意義。 第一部分 殼聚糖膜的制備及性能檢測 目的：制備適合細胞培養(yǎng)的殼聚糖膜，并檢測其吸水率與體外降解率。 方法：將殼聚糖粉溶于1.5％乙酸，制成2％的濃度，采用流延法傾注于圓形蓋玻片上，直

5、徑與24孔培養(yǎng)板孔徑一致，烘干后成膜。測試2％殼聚糖膜的吸水率與體外降解率。 結果：殼聚糖膜表面平整，與蓋玻片附著緊密，無卷邊現象。2％殼聚糖膜的吸水率均值為106.5％，殼聚糖膜的降解速度明顯慢于實驗組，60d重量僅喪失了17.8％。在含溶菌酶的降解液中降解速度較快：10d時，重量喪失達8.8％；30d時，重量喪失達30％左右；40d時，重量喪失約一半左右；60d時已基本降解完全。 結論：殼聚糖具有良好的成膜性和潤濕性

6、。在溶菌酶中，殼聚糖膜具有較快的降解速度。 第二部分 殼聚糖膜對轉染hBMP 2基因的NIH3T3細胞增殖活性的影響 目的：探討轉基因細胞在殼聚糖膜上粘附、生長和增殖情況。 方法：首先作轉基因細胞的生長曲線，然后將轉基因細胞消化后，種植于殼聚糖膜表面，以蓋玻片為對照，6h后檢測初始粘附率，2、4、6d時在倒置光學顯微鏡、掃描電鏡下，觀察細胞的粘附和生長情況，用MTT增殖實驗檢測增殖情況。 結果：NIH3T

7、3細胞在轉入基因后，增殖能力略有降低。6h初始粘附率實驗組高于對照組。殼聚糖膜能夠促進轉基因細胞在其表面的粘附和形態(tài)保持，增殖指數增高(P<0.05)。 結論：殼聚糖膜支持轉基因細胞的粘附、生長和增殖。 第三部分 殼聚糖膜對轉染hBMP2基因的NIH3T3細胞堿性磷酸酶活性的影響 目的：觀察殼聚糖膜對轉基因細胞成骨分化能力的影響。 方法：將轉基因細胞消化后，種植于殼聚糖膜表面，以蓋玻片為對照組，2、4、6