E3連接酶Pirh2在多發(fā)性骨髓瘤硼替佐米耐藥中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種單克隆漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤，可引起骨病變、腎功能受損、貧血等臨床癥狀和多器官功能障礙，其發(fā)病率已居血液系統(tǒng)惡性腫瘤第二位。MM在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅國民的生活和健康。蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib，Bor)是目前治療MM的最有效藥物之一，以其為基礎(chǔ)的化療方案治療MM患者總體有效率高達(dá)80-90％，但原發(fā)及繼發(fā)性耐藥是Bor

2、治療MM失敗的主要原因，嚴(yán)重影響B(tài)or的療效。因此進(jìn)一步探究MM耐藥機(jī)制，尋找克服Bor耐藥的方法，是臨床上亟待解決的關(guān)鍵問題。泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要方式，這種蛋白質(zhì)降解途徑在時間和空間上精確調(diào)控胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)含量，其中E3泛素連接酶決定蛋白質(zhì)降解的特異性。近年來，越來越多的證據(jù)表明，泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)組分的異常，特別是決定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解蛋白特異性的E3連接酶的異常，和腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及藥物耐藥密切相

3、關(guān)，在維持MM細(xì)胞生長生存中亦發(fā)揮關(guān)鍵性作用。因此，深入研究E3連接酶在MM發(fā)生發(fā)展及耐藥中的作用，對尋求臨床治療新靶點(diǎn)，判斷預(yù)后有著重要意義。Pirh2是新發(fā)現(xiàn)的E3連接酶，最早被認(rèn)為可協(xié)同雙微體基因HDM2癌蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)p53的作用，受p53誘導(dǎo)激活并調(diào)控p53。近年隨著研究的深入，能夠和Pirh2相互作用的底物蛋白被逐漸發(fā)現(xiàn)，研究證實(shí)Pirh2與惡性腫瘤發(fā)生及預(yù)后相關(guān)，Pirh2可根據(jù)其底物特異性，既發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的作用，也可以抑制

4、腫瘤發(fā)生，在不同類型腫瘤中發(fā)揮不同的作用。已有文獻(xiàn)報道Pirh2參與漿細(xì)胞的增殖調(diào)控，而我們前期研究通過基因表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn)Pirh2在MM Bor耐藥細(xì)胞株中表達(dá)降低。值得關(guān)注的是究竟Pirh2在血液系統(tǒng)惡性腫瘤MM Bor耐藥中是否發(fā)生作用，是否可作用于相關(guān)底物蛋白，從而介導(dǎo)Bor耐藥及其具體機(jī)制仍未可知。遂本實(shí)驗在此基礎(chǔ)上，深入研究E3連接酶Pirh2在MM Bor耐藥中的作用及其機(jī)制。
　　研究目的:
　　1.明確MM

5、中，Pirh2與Bor耐藥的關(guān)系，同時構(gòu)建Bor耐藥細(xì)胞株模型進(jìn)一步研究Pirh2在Bor耐藥中的作用;
　　2.構(gòu)建Pirh2敲除及過表達(dá)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染MM細(xì)胞，探討Pirh2對MM細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,揭示Pirh2在MM中的角色，并研究其具體機(jī)制;
　　3.探究MM細(xì)胞中可能與Pirh2相互作用的底物蛋白，從而介導(dǎo)Bor耐藥。初步研究Pirh2在MM細(xì)胞中參與哪些蛋白的泛素化調(diào)控。
　　研究方法:
　　1

6、.利用免疫熒光、Western blot、RT-PCR技術(shù)分別檢測Pirh2在MM細(xì)胞株RPMI8226、ARP-1、ARK、MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中的表達(dá)情況，并比較Pirh2在新診斷和難治復(fù)發(fā)MM患者（骨髓CD138+細(xì)胞）中的表達(dá)差異;同時濃度遞增法建立Bor耐藥細(xì)胞株NCI-H929.BR，并在耐藥株中觀察Pirh2的表達(dá)變化;
　　2.用慢病毒載體構(gòu)建Pirh2敲除及過表達(dá)的MM細(xì)胞，

7、利用CCK-8法、流式細(xì)胞分析術(shù)測定Pirh2敲除及過表達(dá)對骨髓瘤細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響。在此基礎(chǔ)上加用Bor觀察其療效改變，Western blot進(jìn)一步檢測Pirh2敲除及過表達(dá)后相關(guān)蛋白的改變;
　　3.免疫共沉淀Co-IP技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析尋找MM細(xì)胞中可能與Pirh2相互作用的底物蛋白;
　　4.基因表達(dá)譜芯片篩選Bor耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞基因表達(dá)差異，同時對Pirh2敲除、Pirh2過表達(dá)及對照組細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)

8、譜芯片篩查，結(jié)合Co-IP及質(zhì)譜分析結(jié)果，探尋受Pirh2調(diào)控并在Bor耐藥中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子;
　　5.構(gòu)建MM荷瘤小鼠模型，皮下注射Pirh2敲除、過表達(dá)及對照組MM細(xì)胞ARP-1-Pirh2，ARP-1-ctl，NCI-H929-kd、NCI-H929-ctl構(gòu)建MM移植瘤NOD/SCID小鼠模型，在體內(nèi)驗證Pirh2對骨髓瘤細(xì)胞的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.Western blot、RT-PCR結(jié)果顯示P

9、irh2在MM細(xì)胞株RPMI8226、ARP-1、ARK、MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中均表達(dá)，其中在ARK、ARP-1和LP-1細(xì)胞株中相對低表達(dá)，免疫熒光結(jié)果顯示Pirh2在上述MM細(xì)胞中以胞漿表達(dá)為主。RT-PCR檢測結(jié)果顯示Pirh2在原代MM細(xì)胞（患者骨髓CD138+細(xì)胞）中也存在表達(dá)，其中難治復(fù)發(fā)患者Pirh2表達(dá)低于新診斷未治療的MM患者(p＜0.05);
　　2.采用濃度遞增法自骨髓瘤

10、細(xì)胞系NCI-H929成功建立Bor耐藥株NCI-H929.BR，持續(xù)刺激6個月，CCK-8法檢測Bor對親本NCI-H929和NCI-H929.BR24h的IC50，分別為17.62±1.92 nmol/L和234.30±6.02 nmol/L，耐藥倍數(shù)為13.30(P＜0.05)。生長曲線及流式細(xì)胞分析術(shù)結(jié)果顯示NCI-H929親本和NCI-H929.BR的生長曲線和細(xì)胞周期分布無顯著性差異(P＞0.05);
　　3.West

11、ern blot檢測Bor耐藥株NCI-H929.BR建立過程中Pirh2蛋白表達(dá)變化，結(jié)果提示在Bor的反復(fù)刺激下，隨著耐藥株建立的時間推移，Pirh2蛋白表達(dá)逐漸降低。在RPMI8226、RPMI8226.BR和OPM-2、OPM-2.BR細(xì)胞株中也得到同樣結(jié)果;
　　4.MM細(xì)胞未予Bor處理時，Pirh2敲除或者過表達(dá)對MM細(xì)胞的周期、增殖、凋亡影響不明顯(P＞0.05);
　　5.Pirh2敲除可降低MM細(xì)胞對Bo

12、r敏感性，且細(xì)胞G1期阻滯明顯降低。流式細(xì)胞分析術(shù)結(jié)果顯示RPMI8226-kd、RPMI8226-ctl G1期比例分別為39.03±3.20％ vs52.84±2.89％。OPM-2-kd、OPM-2-ctl G1期比例分別為42.40±5.84％vs57.00±6.23％。NCI-H929-kd、NCI-H929-ctl G1期比例分別為23.37±2.12％vs42.91±1.89％，和對照組相比，Pirh2敲除后Bor誘導(dǎo)的細(xì)

13、胞G1期阻滯明顯降低(p＜0.05)。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示敲除Pirh2后，Bor抑制細(xì)胞增殖能力減弱。AnnexinⅤ凋亡分析顯示與對照組相比，敲除Pirh2組Bor誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡減低。RPMI8226-kd、RPMI8226-ctl凋亡率分別為47.90±1.63％vs55.60±2.86％;OPM-2-kd、OPM-2-ctl凋亡率分別為48.30±1.17％vs63.60±1.24％;NCI-H929-kd、NCI-H

14、929-ctl凋亡率分別為20.28±0.98％vs38.37±1.34％，Pirh2敲除后Bor誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯減少(p＜0.05);
　　6.Pirh2過表達(dá)可增加MM細(xì)胞對Bor敏感性，且細(xì)胞G1期阻滯明顯增加。ARP-1-Pirh2、ARP-1-ctl G1期比例分別為51.56±3.91％ vs40.88±2.09％。ARK-Pirh2、ARK-ctl G1期比例分別為49.10±4.32％vs31.90±3.98％。

15、LP-1-Pirh2、 LP-1-ctl G1期比例分別為58.90±4.06％vs32.40±2.76％，和對照組相比，Pirh2過表達(dá)后Bor誘導(dǎo)的細(xì)胞G1期阻滯明顯增加(p＜0.05)。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示Pirh2過表達(dá)后，Bor抑制細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。凋亡分析顯示，加用Bor處理24h后，與對照組相比，Pirh2組Bor誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。ARP-1-Pirh2、ARP-1-ctl凋亡率分別為66.90±3.73％vs

16、41.70±1.86％。ARK-Pirh2、ARK-ctl凋亡率分別為76.80±4.17％vs66.60±3.24％。LP-1-Pirh2、LP-1-ctl凋亡率分別為22.02±1.23％vs15.53±2.03％，和對照組相比，Pirh2過表達(dá)細(xì)胞Bor誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加(p＜0.05)。
　　7.Western blot結(jié)果顯示Pirh2敲除細(xì)胞株RPMI8226-kd、OPM-2-kd及NCI-H929-kdc-myc和p

17、53表達(dá)水平增加，而Pirh2過表達(dá)細(xì)胞株ARP-1-Pirh2、 ARK-Pirh2、LP-1-Pirh2 c-myc和p53表達(dá)水平降低。在Pirh2敲除或過表達(dá)的MM細(xì)胞中，HDAC1、Tip60、USP28等蛋白水平均無明顯改變;
　　8.小鼠荷瘤實(shí)驗證實(shí)Pirh2對皮下成瘤能力無明顯影響，但Pirh2敲除后腫瘤組織c-myc表達(dá)水平增加。而Pirh2過表達(dá)后腫瘤組織c-myc表達(dá)水平降低;
　　9.免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)

18、譜分析鑒定Pirh2相互作用蛋白，結(jié)果提示Pirh2可能與代謝相關(guān)的蛋白DLAT、PDHX、PDHA1、PDHB，E3連接酶TRIM21及核糖體蛋白RPL13、RPL10等相互作用，基因芯片結(jié)果顯示其中TRIM21、RPL13在骨髓瘤Bor耐藥細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，提示其在MM細(xì)胞中可能參與Bor敏感性的調(diào)控，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　結(jié)論:
　　1.骨髓瘤細(xì)胞Pirh2低表達(dá)和Bor耐藥相關(guān)，Pirh2在MM細(xì)胞株RPMI

19、8226、ARP-1、ARK、MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中普遍表達(dá)，其中在ARK、ARP-1和LP1細(xì)胞株中相對低表達(dá);Pirh2在難治復(fù)發(fā)MM患者中表達(dá)低于新診斷未治療患者，成功構(gòu)建Bor耐藥細(xì)胞株，并證實(shí)Pirh2在耐藥株中表達(dá)下調(diào);
　　2.Pirh2敲除或過表達(dá)對MM細(xì)胞本身增殖及細(xì)胞周期無明顯影響，Pirh2敲除細(xì)胞株RPMI8226-kd、OPM-2-kd及NCI-H929-kd對Bor

20、敏感性降低，而Pirh2過表達(dá)細(xì)胞株ARP-1-Pirh2、ARK-Pirh2、LP-1-Pirh2對Bor敏感性增強(qiáng);
　　3.Pirh2可通過c-myc、p53介導(dǎo)Bor誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、凋亡和周期調(diào)控，介導(dǎo)Bor耐藥;
　　4.免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定Pirh2相互作用蛋白，結(jié)果提示Pirh2可能與代謝相關(guān)的蛋白DLAT、PDHX、PDHA1、PDHB，E3連接酶TRIM21及核糖體蛋白RPL13、RPL10等相互作用