ZNF84在HPV16相關(guān)宮頸鱗癌發(fā)生與演進(jìn)中的作用.pdf

1、背景:
　　高危型人乳頭瘤病毒（high risk-human papillomaviruses，HR-HPVs）與宮頸癌存在病因?qū)W關(guān)系，其早期基因E6的持續(xù)表達(dá)是其致癌的重要因素。鋅指蛋白(zinc fingerprotein，ZNF)家族與多種腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)密切相關(guān)，ZNF84是ZNF家族重要成員之一。本課題組經(jīng)Agilent人基因表達(dá)譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)沉默E6表達(dá)后，ZNF84基因表達(dá)下調(diào)。HPV16 E6與ZNF84的關(guān)系

2、尚不清楚。
　　目的:
　　以HPV16 E6表達(dá)陽(yáng)性的宮頸鱗癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelialneoplasia，CIN)組織、富頸鱗狀上皮組織、宮頸癌細(xì)胞株（宮頸癌SiHa細(xì)胞）以及HPV16 E6表達(dá)陰性的宮頸鱗癌組織、CIN組織、宮頸鱗狀上皮組織、宮頸癌細(xì)胞株（宮頸癌C33-A細(xì)胞）為研究對(duì)象，研究ZNF84在HPV16相關(guān)宮頸癌發(fā)生與演進(jìn)中的表達(dá)及作用，為進(jìn)一步研究HPV16相

3、關(guān)宮頸癌防治措施提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1.通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)ZNF84在宮頸癌SiHa細(xì)胞（HPV16 E6表達(dá)陽(yáng)性）和宮頸癌C33-A細(xì)胞(HPV16 E6表達(dá)陰性)中的表達(dá)。
　　2.通過(guò)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色方法檢測(cè)ZNF84在HPV16 E6表達(dá)陽(yáng)性的宮頸鱗狀上皮組織、CIN組織、宮頸鱗癌組織和HPV16 E6表達(dá)陰性的宮頸鱗狀上

4、皮組織、CIN組織、宮頸鱗癌組織中的表達(dá)，并分析二者之間表達(dá)的關(guān)系。
　　3.設(shè)計(jì)以ZNF84 mRNA為靶點(diǎn)的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列，構(gòu)建pGenesil-1-shRNA-ZNF84重組質(zhì)粒和含無(wú)關(guān)序列的pGenesil-1-shRNA-vect對(duì)照質(zhì)粒。
　　4.經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入HVP16 E6表達(dá)陽(yáng)性的宮頸癌SiHa細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)染pGenesil-1-shRNA

5、-ZNF84重組質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞命名為SiHa-shRNA-ZNF84細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pGenesil-1-shRNA-vect對(duì)照質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞命名為SiHa-shRNA-vect細(xì)胞。篩選鑒定后，通過(guò)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)等觀察HPV16 E6表達(dá)陽(yáng)性的宮頸癌SiHa細(xì)胞在ZNF84表達(dá)沉默后遷移和侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.Western blotting結(jié)果顯示:HPV16 E6在宮頸癌C33-A

6、細(xì)胞中不表達(dá)，而HPV16 E6在宮頸癌SiHa細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)。ZNF84在HPV16 E6表達(dá)陰性的C33-A細(xì)胞和HPV16 E6表達(dá)陽(yáng)性的SiHa細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)，但C33-A細(xì)胞中ZNF84的表達(dá)顯著低于SiHa細(xì)胞(P＜0.01)。
　　2.IHC結(jié)果顯示:ZNF84在HPV16 E6表達(dá)陽(yáng)性的宮頸鱗狀上皮組織、CIN組織和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)均分別顯著高于其在HPV16 E6表達(dá)陰性的宮頸鱗狀上皮組織、CIN組織和

7、宮頸鱗癌組織中的表達(dá)，二者表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.01)。
　　3.以ZNF84 mRNA為靶點(diǎn)的shRNA對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞中ZNF84表達(dá)的沉默效應(yīng)。Western blotting方法檢測(cè)各組細(xì)胞中ZNF84表達(dá)（以β-actin為內(nèi)參照）的結(jié)果顯示:ZNF84在SiHa-shRNA-ZNF84細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于其在SiHa細(xì)胞和SiHa-shRNA-vect細(xì)胞中的表達(dá)(P＜0.01)，沉默效率為:95.630％。與Si

8、Ha細(xì)胞相比，ZNF84在SiHa-shRNA-vect細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　4.ZNF84表達(dá)沉默對(duì)HPV16 E6表達(dá)陽(yáng)性的宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均顯示:SiHa-shRNA-ZNF84細(xì)胞穿過(guò)小室底膜的細(xì)胞數(shù)顯著少SiHa-shRNA-vect細(xì)胞(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.證明了E6和ZNF84在HPV16 E6表達(dá)陽(yáng)性