Daxx-C抗體的制備及其在HPV16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞中的初步應(yīng)用.pdf

1、目的：研制Daxx-C抗體，觀察Daxx在人乳頭瘤病毒16型(HPV16)陽(yáng)性宮頸癌組織中的分布，分析Daxx與ATRX在Caski細(xì)胞中的定位和共定位，為進(jìn)一步探討Daxx在HPV16所致宮頸癌進(jìn)程中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　(1)利用PRIMER5.0軟件，設(shè)計(jì)Daxx-C基因片段(626-740氨基酸殘基)引物，分別引入酶切位點(diǎn)BamHI與SalI，PCR擴(kuò)增目的基因。將PCR產(chǎn)物連入載體pMD18-T

2、，構(gòu)建pMD18-T/DM626-740；然后，將BamHI和SalI酶切產(chǎn)物連入載體pET28a，經(jīng)酶切鑒定及DNA序列分析后，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a/DM626-740。
　　(2）將質(zhì)粒pET28a/DM626-740轉(zhuǎn)化E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用 Ni瓊脂糖凝膠層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物，Western-blot檢測(cè)6His-DM626-740融合蛋白及其純化物。
　　(3)將6His-DM626-

3、740純化物以皮下多點(diǎn)注射和腹腔注射方式免疫接種4只8周齡雌性BALB/c小鼠；初次免疫3周后，再免疫1次；以后每1周加強(qiáng)免疫1次，共2次。每次免疫前及末次免疫后7天取血，ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。飽和硫酸銨鹽析沉淀法初步純化抗血清，并用Western blot檢測(cè)之。
　　(4)收集正常宮頸上皮細(xì)胞、HPV16陽(yáng)性不同級(jí)宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）和不同期宮頸癌病理標(biāo)本，利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)組織細(xì)胞中Daxx的分布與定位。
　　

4、(5)培養(yǎng)Caski細(xì)胞，利用間接免疫熒光試驗(yàn)和圖像軟件，觀察Daxx和ATRX在細(xì)胞中的分布與定位，分析兩者的共定位。
　　結(jié)果：
　　(1)雙酶切和DNA測(cè)序結(jié)果顯示，PCR正確擴(kuò)增了Daxx-C基因片段 DM626-740，并成功連入載體pMD18-T或pET28a，構(gòu)建了質(zhì)粒pMD18-T/DM626-740與pET28a/DM626-740。
　　(2) pET28a/DM626-740在E.coli中誘導(dǎo)表

5、達(dá)分子量約19kDa目的蛋白6His-DM626-740，且該蛋白能被抗Daxx抗體檢出。
　　(3)融合蛋白6His-DM626-740純化物免疫小鼠后，制備的抗Daxx-C多克隆抗體效價(jià)為1:6400。(4)光學(xué)顯微鏡下，在正常宮頸上皮細(xì)胞，呈棕黃色的Daxx分布于細(xì)胞核；在CINⅠ， Daxx主要分布于核膜，核內(nèi)有少量分布；在CINⅡ、CINⅢ、原位癌和浸潤(rùn)型宮頸癌中，Daxx密集分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。
　　(5)在C

6、aski細(xì)胞，顯綠色信號(hào)的Daxx主要分布于胞漿，少數(shù)分布于胞核且在核膜附近熒光較強(qiáng)，呈區(qū)域性聚集；顯紅色信號(hào)的ATRX主要分布于細(xì)胞核，少量表達(dá)于細(xì)胞漿；綠色信號(hào)與紅色信號(hào)融合后出現(xiàn)黃色信號(hào)。
　　結(jié)論：
　?。?）構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a/DM626-740能在E.coli中表達(dá)目的蛋白6His-DM626-740。（2）研制的Daxx-C抗體可用于檢測(cè)組織細(xì)胞中的Daxx。在HPV16所致宮頸癌進(jìn)程中，Daxx從