分泌型IgA在IgA腎病發(fā)病中的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是我國乃至全球最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，其特征是免疫熒光下見到以IgA為主的免疫復合物在腎小球系膜區(qū)和/或腎小球毛細血管襻沉積。據(jù)2014年最新資料顯示，全球 IgAN的發(fā)病率為2.5人/10萬人/每年，約20％-50%的患者20年可進展為終末期腎臟病。但是， IgAN的發(fā)病機制仍然不十分清楚。因IgAN患者常在上呼吸道或腸道等粘膜感染后發(fā)生肉眼血尿和/或蛋白尿，提

2、示粘膜免疫與IgAN的發(fā)病機制密切相關。分泌型IgA（secretory IgA，SIgA）是參與粘膜免疫最重要的抗體，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SIgA在 IgAN的發(fā)病中可能也起著一定的致病作用。IgAN的病理類型及臨床表現(xiàn)具有多樣性，是否因為有 SIgA的參與？SIgA可以沉積在 IgAN患者的系膜區(qū)，那么它對系膜細胞具有損傷作用嗎？SIgA發(fā)揮這些致病損傷作用的機制是什么呢？迄今為止，還未見相關報道。MicroRNAs(miRNAs)是

3、真核生物中一類具有內(nèi)源性調(diào)控功能的非編碼RNA，它通過與靶基因信使 RNA（messenger RNA，mRNA）的3’端非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合，發(fā)揮抑制翻譯的作用。研究提示，miRNAs在腎臟病中也起了重要的作用。那么SIgA是否通過作用miRNAs來發(fā)揮在IgAN中的致病性呢？
　　第一部分、IgA腎病患者分泌型IgA在腎組織的沉積以及同臨床病理之間的關系
　　目的：
　　檢

4、測IgAN患者腎組織中SIgA沉積的比例；分析SIgA與臨床及腎臟病理之間的關系。
　　方法：
　　選取263名原發(fā)性IgAN患者，應用激光共聚焦顯微鏡觀察腎組織SIgA的沉積，并比較有SIgA沉積和無沉積患者的臨床及腎臟病理各項指標的不同。
　　結(jié)果：
　　1.263名IgAN患者中87名可見到系膜區(qū)SIgA的沉積，約占29.28%；
　　2.同系膜區(qū)無SIgA沉積的病人相比較，有SIgA沉積的病人具有明

5、顯的感染史（P=0.016）及血尿（P=0.024）發(fā)生率，臨床指標上具有明顯低水平的血清胱抑素C（P=0.027）和β2微球蛋白（P=0.018），病理特征上具有更微的腎臟小管間質(zhì)損傷（P=0.030）和更低的T評分（牛津分型，P=0.026）。
　　結(jié)論：
　　粘膜免疫同IgAN密切相關，SIgA參與了IgAN的發(fā)病，它在腎組織的沉積與某些的臨床腎臟病理指標相聯(lián)系。
　　第二部分、分泌型IgA在IgAN患者腎組織激

6、活的補體通路研究
　　目的：
　　檢測IgAN患者腎組織中SIgA激活的補體通路來研究SIgA的腎損傷作用，以及比較腎組織經(jīng)不同補體途徑激活的IgAN患者之間的臨床病理特征。
　　方法：
　　選取87名原發(fā)性IgAN患者，應用激光共聚焦顯微鏡觀察腎組織SIgA以及各補體通路相關蛋白的沉積，探討SIgA與各補體通路激活的關系，并比較不同補體激活通路的患者臨床及腎病理特點之間的差別。
　　結(jié)果：
　　1.

7、87名IgAN患者中有22名可見到系膜區(qū)SIgA沉積，其中經(jīng)旁路途徑激活的占77.27%，在65名無SIgA沉積的患者中經(jīng)凝集素途徑激活的占72.30%，兩組比較無明顯差別（P=0.648）；
　　2.同腎組織經(jīng)凝集素途徑激活的患者相比較，經(jīng)旁路途徑激活的64人（73.6%）在臨床指標方面具有更低的腎小球濾過率（P=0.043），在腎病理方面腎小球硬化比例（P=0.035）、小管間質(zhì)損傷程度（P=0.030）、C3的免疫熒光強度（

8、P=0.012）以及牛津評分的S（P=0.006）和T評分（P=0.039）均損傷更嚴重。
　　結(jié)論：
　　在IgAN中SIgA具有致病性，可能通過激活旁路途徑和凝集素途徑造成腎損傷；經(jīng)旁路途徑激活的IgAN患者部分臨床和腎病理特征比經(jīng)凝集素途徑激活的患者嚴重。
　　第三部分、分泌型IgA對系膜細胞的生物學效應研究
　　目的：
　　研究SIgA對人系膜細胞的生物學效應，探討SIgA在IgAN中的致病作用。<

9、br>　　方法：
　　運用親和層析柱提純IgAN患者及正常人唾液中的SIgA，應用親和層析柱和分子篩提純IgAN患者及正常人血中的多聚IgA（polymeric IgA，pIgA）；將提純的SIgA及pIgA分別刺激人系膜細胞，檢測細胞的增殖及各種促炎促纖維化因子（IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纖維粘連蛋白）在細胞中mRNA及蛋白水平的表達情況，并相互比較。
　　結(jié)果：
　　1.SIgA和pIgA均能使

10、人系膜細胞明顯增殖（P<0.05），表達IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纖維粘連蛋白明顯增多（mRNA和蛋白水平，P<0.05），并且患者來源的SIgA和pIgA對細胞的上述生物學效應均明顯強于正常人來源的刺激作用（P<0.05）；
　　2.經(jīng)IgAN患者唾液純化的SIgA對系膜細胞的增殖作用及刺激其分泌IL-6、IL-8和纖維粘連蛋白的作用要明顯弱于經(jīng)IgAN患者血清純化的pIgA作用（P<0.05）。
　　

11、結(jié)論：
　　在IgAN中SIgA有致病作用，SIgA具有刺激系膜細胞增殖和釋放促炎促纖維化細胞因子的生物學效應，并且SIgA與pIgA對系膜細胞的生物學效應是不完全相同的。
　　第四部分與分泌型IgA致病性有關的microRNAs篩選及驗證
　　目的：
　　篩選與SIgA致病性有關的miRNAs，研究SIgA在IgAN中產(chǎn)生致病性的分子機制。
　　方法：
　　運用Agilent human miRNA

12、s芯片，檢測經(jīng)IgAN患者及正常人SIgA刺激的系膜細胞中的miRNAs，并分析篩選其中差異性表達的miRNAs，應用實時熒光定量PCR分別進行驗證。
　　結(jié)果：
　　1.通過miRNAs芯片篩選了17個經(jīng)IgAN患者及正常人的SIgA刺激后細胞內(nèi)差異表達的miRNAs，其中上調(diào)5個、下調(diào)12個；
　　2.經(jīng)實時熒光定量 PCR驗證芯片篩選結(jié)果中的miRNAs，趨勢均一致，其中16個表達差異顯著（P<0.05），1個差

13、異性不顯著（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　SIgA在IgAN發(fā)揮致病性的機制中，miRNAs參與其中。
　　第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p調(diào)控IL-6和IL-8的分子機制
　　目的：
　　預測和驗證了miR-16-2-3p和miR-100-3p的靶基因，進一步探討SIgA在IgAN中產(chǎn)生致病性的分子機制。
　　方法：
　　通過生物信息學方法對miRNAs芯片篩選結(jié)果中的

14、miR-16-2-3p和miR-100-3p進行靶基因預測，建立融合靶基因3‘UTR的熒光素酶報告基因載體，通過雙報告熒光素酶基因檢測方法確定miR-16-2-3p和miR-100-3p的靶基因；應用實時熒光定量PCR和Western blot研究miR-16-2-3p和miR-100-3p對其靶基因的內(nèi)源性調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了能夠過表達miR-16-2-3p和miR-100-3p的報告基因載體；

15、>　　2.熒光素酶雙報告基因檢測顯示，miR-16-2-3p和miR-100-3p的復制物可以分別與報告基因載體的IL-6和IL-83’UTR野生序列結(jié)合，使載體的熒光素酶活性降低，而IL-6和IL-83’UTR突變序列不能產(chǎn)生這樣的作用（P<0.05）；
　　3.MiR-16-2-3p過表達可以抑制SIgA刺激系膜細胞中分泌IL-6蛋白過多的情況，但不影響IL-6 mRNA的水平（P>0.05），同樣miR-100-3p過表達可

16、以抑制其分泌IL-8蛋白過多的情況，但不能影響IL-8 mRNA的水平（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　MiR-16-2-3p的靶基因是IL-6，miR-100-3p的靶基因是IL-8；SIgA通過作用miR-16-2-3p和miR-100-3p來分別調(diào)控系膜細胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6和IL-8，是SIgA在IgAN中產(chǎn)生致病性的分子機制之一。
　　全文結(jié)論
　　SIgA參與了IgAN的發(fā)病，它在腎組織的沉積同一