分泌型IgA在IgA腎病發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是我國(guó)乃至全球最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎，其特征是免疫熒光下見(jiàn)到以IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)和/或腎小球毛細(xì)血管襻沉積。據(jù)2014年最新資料顯示，全球 IgAN的發(fā)病率為2.5人/10萬(wàn)人/每年，約20％-50%的患者20年可進(jìn)展為終末期腎臟病。但是， IgAN的發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚。因IgAN患者常在上呼吸道或腸道等粘膜感染后發(fā)生肉眼血尿和/或蛋白尿，提

2、示粘膜免疫與IgAN的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。分泌型IgA（secretory IgA，SIgA）是參與粘膜免疫最重要的抗體，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，SIgA在 IgAN的發(fā)病中可能也起著一定的致病作用。IgAN的病理類(lèi)型及臨床表現(xiàn)具有多樣性，是否因?yàn)橛?SIgA的參與？SIgA可以沉積在 IgAN患者的系膜區(qū)，那么它對(duì)系膜細(xì)胞具有損傷作用嗎？SIgA發(fā)揮這些致病損傷作用的機(jī)制是什么呢？迄今為止，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。MicroRNAs(miRNAs)是

3、真核生物中一類(lèi)具有內(nèi)源性調(diào)控功能的非編碼RNA，它通過(guò)與靶基因信使 RNA（messenger RNA，mRNA）的3’端非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合，發(fā)揮抑制翻譯的作用。研究提示，miRNAs在腎臟病中也起了重要的作用。那么SIgA是否通過(guò)作用miRNAs來(lái)發(fā)揮在IgAN中的致病性呢？
　　第一部分、IgA腎病患者分泌型IgA在腎組織的沉積以及同臨床病理之間的關(guān)系
　　目的：
　　檢

4、測(cè)IgAN患者腎組織中SIgA沉積的比例；分析SIgA與臨床及腎臟病理之間的關(guān)系。
　　方法：
　　選取263名原發(fā)性IgAN患者，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察腎組織SIgA的沉積，并比較有SIgA沉積和無(wú)沉積患者的臨床及腎臟病理各項(xiàng)指標(biāo)的不同。
　　結(jié)果：
　　1.263名IgAN患者中87名可見(jiàn)到系膜區(qū)SIgA的沉積，約占29.28%；
　　2.同系膜區(qū)無(wú)SIgA沉積的病人相比較，有SIgA沉積的病人具有明

5、顯的感染史（P=0.016）及血尿（P=0.024）發(fā)生率，臨床指標(biāo)上具有明顯低水平的血清胱抑素C（P=0.027）和β2微球蛋白（P=0.018），病理特征上具有更微的腎臟小管間質(zhì)損傷（P=0.030）和更低的T評(píng)分（牛津分型，P=0.026）。
　　結(jié)論：
　　粘膜免疫同IgAN密切相關(guān)，SIgA參與了IgAN的發(fā)病，它在腎組織的沉積與某些的臨床腎臟病理指標(biāo)相聯(lián)系。
　　第二部分、分泌型IgA在IgAN患者腎組織激

6、活的補(bǔ)體通路研究
　　目的：
　　檢測(cè)IgAN患者腎組織中SIgA激活的補(bǔ)體通路來(lái)研究SIgA的腎損傷作用，以及比較腎組織經(jīng)不同補(bǔ)體途徑激活的IgAN患者之間的臨床病理特征。
　　方法：
　　選取87名原發(fā)性IgAN患者，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察腎組織SIgA以及各補(bǔ)體通路相關(guān)蛋白的沉積，探討SIgA與各補(bǔ)體通路激活的關(guān)系，并比較不同補(bǔ)體激活通路的患者臨床及腎病理特點(diǎn)之間的差別。
　　結(jié)果：
　　1.

7、87名IgAN患者中有22名可見(jiàn)到系膜區(qū)SIgA沉積，其中經(jīng)旁路途徑激活的占77.27%，在65名無(wú)SIgA沉積的患者中經(jīng)凝集素途徑激活的占72.30%，兩組比較無(wú)明顯差別（P=0.648）；
　　2.同腎組織經(jīng)凝集素途徑激活的患者相比較，經(jīng)旁路途徑激活的64人（73.6%）在臨床指標(biāo)方面具有更低的腎小球?yàn)V過(guò)率（P=0.043），在腎病理方面腎小球硬化比例（P=0.035）、小管間質(zhì)損傷程度（P=0.030）、C3的免疫熒光強(qiáng)度（

8、P=0.012）以及牛津評(píng)分的S（P=0.006）和T評(píng)分（P=0.039）均損傷更嚴(yán)重。
　　結(jié)論：
　　在IgAN中SIgA具有致病性，可能通過(guò)激活旁路途徑和凝集素途徑造成腎損傷；經(jīng)旁路途徑激活的IgAN患者部分臨床和腎病理特征比經(jīng)凝集素途徑激活的患者嚴(yán)重。
　　第三部分、分泌型IgA對(duì)系膜細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究
　　目的：
　　研究SIgA對(duì)人系膜細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，探討SIgA在IgAN中的致病作用。<

9、br>　　方法：
　　運(yùn)用親和層析柱提純IgAN患者及正常人唾液中的SIgA，應(yīng)用親和層析柱和分子篩提純IgAN患者及正常人血中的多聚IgA（polymeric IgA，pIgA）；將提純的SIgA及pIgA分別刺激人系膜細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的增殖及各種促炎促纖維化因子（IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纖維粘連蛋白）在細(xì)胞中mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況，并相互比較。
　　結(jié)果：
　　1.SIgA和pIgA均能使

10、人系膜細(xì)胞明顯增殖（P<0.05），表達(dá)IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纖維粘連蛋白明顯增多（mRNA和蛋白水平，P<0.05），并且患者來(lái)源的SIgA和pIgA對(duì)細(xì)胞的上述生物學(xué)效應(yīng)均明顯強(qiáng)于正常人來(lái)源的刺激作用（P<0.05）；
　　2.經(jīng)IgAN患者唾液純化的SIgA對(duì)系膜細(xì)胞的增殖作用及刺激其分泌IL-6、IL-8和纖維粘連蛋白的作用要明顯弱于經(jīng)IgAN患者血清純化的pIgA作用（P<0.05）。
　　

11、結(jié)論：
　　在IgAN中SIgA有致病作用，SIgA具有刺激系膜細(xì)胞增殖和釋放促炎促纖維化細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng)，并且SIgA與pIgA對(duì)系膜細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)是不完全相同的。
　　第四部分與分泌型IgA致病性有關(guān)的microRNAs篩選及驗(yàn)證
　　目的：
　　篩選與SIgA致病性有關(guān)的miRNAs，研究SIgA在IgAN中產(chǎn)生致病性的分子機(jī)制。
　　方法：
　　運(yùn)用Agilent human miRNA

12、s芯片，檢測(cè)經(jīng)IgAN患者及正常人SIgA刺激的系膜細(xì)胞中的miRNAs，并分析篩選其中差異性表達(dá)的miRNAs，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)miRNAs芯片篩選了17個(gè)經(jīng)IgAN患者及正常人的SIgA刺激后細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的miRNAs，其中上調(diào)5個(gè)、下調(diào)12個(gè)；
　　2.經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR驗(yàn)證芯片篩選結(jié)果中的miRNAs，趨勢(shì)均一致，其中16個(gè)表達(dá)差異顯著（P<0.05），1個(gè)差

13、異性不顯著（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　SIgA在IgAN發(fā)揮致病性的機(jī)制中，miRNAs參與其中。
　　第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p調(diào)控IL-6和IL-8的分子機(jī)制
　　目的：
　　預(yù)測(cè)和驗(yàn)證了miR-16-2-3p和miR-100-3p的靶基因，進(jìn)一步探討SIgA在IgAN中產(chǎn)生致病性的分子機(jī)制。
　　方法：
　　通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)miRNAs芯片篩選結(jié)果中的

14、miR-16-2-3p和miR-100-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，建立融合靶基因3‘UTR的熒光素酶報(bào)告基因載體，通過(guò)雙報(bào)告熒光素酶基因檢測(cè)方法確定miR-16-2-3p和miR-100-3p的靶基因；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot研究miR-16-2-3p和miR-100-3p對(duì)其靶基因的內(nèi)源性調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了能夠過(guò)表達(dá)miR-16-2-3p和miR-100-3p的報(bào)告基因載體；

15、>　　2.熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)顯示，miR-16-2-3p和miR-100-3p的復(fù)制物可以分別與報(bào)告基因載體的IL-6和IL-83’UTR野生序列結(jié)合，使載體的熒光素酶活性降低，而IL-6和IL-83’UTR突變序列不能產(chǎn)生這樣的作用（P<0.05）；
　　3.MiR-16-2-3p過(guò)表達(dá)可以抑制SIgA刺激系膜細(xì)胞中分泌IL-6蛋白過(guò)多的情況，但不影響IL-6 mRNA的水平（P>0.05），同樣miR-100-3p過(guò)表達(dá)可

16、以抑制其分泌IL-8蛋白過(guò)多的情況，但不能影響IL-8 mRNA的水平（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　MiR-16-2-3p的靶基因是IL-6，miR-100-3p的靶基因是IL-8；SIgA通過(guò)作用miR-16-2-3p和miR-100-3p來(lái)分別調(diào)控系膜細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6和IL-8，是SIgA在IgAN中產(chǎn)生致病性的分子機(jī)制之一。
　　全文結(jié)論
　　SIgA參與了IgAN的發(fā)病，它在腎組織的沉積同一