EGF上調(diào)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中P190蛋白表達(dá)機(jī)制的初步探討.pdf

1、前言：
　　血腦屏障(BBB)是維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障性結(jié)構(gòu)，其基本組成主要有人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)、基膜、周細(xì)胞、和星形膠質(zhì)細(xì)胞。其中，HBMEC間的緊密連接和粘附連接是維持血腦屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。血腦屏障的功能依賴于HBMEC形成的細(xì)胞緊密連接，而HBMEC的緊密連接又依賴于緊密連接蛋白的表達(dá)。HBMEC細(xì)胞間緊密連接處的緊密連接蛋白有很多種，包括跨膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白，如ZO-1、claudin、JAM等等。我

2、們實(shí)驗(yàn)室一直致力于血腦屏障功能和結(jié)構(gòu)的研究，并發(fā)現(xiàn)了一種分子量為190KD的蛋白質(zhì)P190在HBMEC中有大量表達(dá)。
　　P190蛋白被證實(shí)是一種神經(jīng)元跨膜蛋白，維持神經(jīng)沖動(dòng)的跳躍式傳導(dǎo)。我們實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)證明P190胞內(nèi)段缺失的HBMEC緊密連接的通透性開放，表明P190蛋白在血腦屏障中可能發(fā)揮重要作用，所以HBMEC中P190蛋白在HBMEC緊密連接中的具體作用以及HBMEC中P190蛋白的表達(dá)調(diào)控情況是我們實(shí)驗(yàn)室研究的重點(diǎn)內(nèi)容

3、。在本研究中，以HBMEC中P190蛋白的表達(dá)調(diào)控情況為研究目的，采用多種神經(jīng)源性生長(zhǎng)因子處理HBMEC收取蛋白樣品Western Blot檢測(cè)其蛋白水平后，發(fā)現(xiàn)了一種能夠穩(wěn)定使HBMEC中P190蛋白升高的生長(zhǎng)因子—表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。EGF能夠使HBMEC中P190蛋白升高的現(xiàn)象提示我們EGF可能是調(diào)控HBMEC中P190蛋白的重要生長(zhǎng)因子，因此我們的研究?jī)?nèi)容是探究EGF使HBMEC中P190升高的機(jī)制。
　　方法：

4、>　　一、Westrn Blot方法找到可以調(diào)控HBMEC中P190蛋白表達(dá)的生長(zhǎng)因子
　　不同的腦源性生長(zhǎng)因子刺激HBMEC后按時(shí)間點(diǎn)不同收取蛋白樣品，WesternBlot方法檢測(cè)各種生長(zhǎng)因子對(duì)HBMEC中P190蛋白表達(dá)的影響情況，找到可以穩(wěn)定影響HBMEC中P190蛋白表達(dá)的生長(zhǎng)因子。
　　二、EGF使HBMEC中P190蛋白水平升高機(jī)制的初步研究
　　1、利用real-time PCR的方法驗(yàn)證EGF使HBM

5、EC中P190蛋白升高是否通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄水平
　　2、使用翻譯阻斷劑CHX驗(yàn)證EGF使HBMEC中P190蛋白升高是否通過(guò)蛋白翻譯水平
　　3、使用蛋白降解抑制劑MG132研究HBMEC中P190蛋白是否通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解
　　4、應(yīng)用信號(hào)通路抑制劑篩查EGF調(diào)控HBMEC中P190蛋白表達(dá)的信號(hào)通路
　　結(jié)果：
　　一、從神經(jīng)源性生長(zhǎng)因子中篩選到EGF可以調(diào)控P190蛋白的表達(dá)
　　備篩選的生

6、長(zhǎng)因子有BDNF、VEGF、PDGF、Wnt3a、TGF-β和EGF，結(jié)果表明只有EGF可以使HBMEC中P190蛋白水平升高，其他生長(zhǎng)因子沒有明顯改變趨勢(shì)。
　　二、EGF使HBMEC中P190蛋白水平升高的機(jī)制
　　1、EGF使HBMEC中p190蛋白水平的升高呈劑量和時(shí)間依賴性，最適濃度為50ng/ml，HBMEC中P190蛋白升高的峰值時(shí)間點(diǎn)為12h。
　　2、EGF使HBMEC中P190蛋白水平改變與轉(zhuǎn)錄水平

7、無(wú)關(guān)，50ng/ml EGF作用HBMEC，HBMEC中的P190 mRNA水平并沒有隨P190蛋白水平升高出現(xiàn)而升高。
　　3、EGF使HBMEC中P190蛋白水平改變與翻譯水平無(wú)關(guān)
　　蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程的阻斷劑CHX和EGF共同處理HBMEC組，與EGF處理HBMEC組比較，CHX不能阻斷EGF使HBMEC中P190蛋白升高。
　　4、P190蛋白可以通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解
　　蛋白質(zhì)降解的泛素-蛋白酶體途

8、徑抑制劑MG132處理HBMEC后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，HBMEC中P190蛋白出現(xiàn)升高現(xiàn)象，說(shuō)明MG132可以抑制HBMEC中P190蛋白的降解，提示HBMEC中P190蛋白可以通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解。
　　5、JNK信號(hào)通路可能參與EGF調(diào)控HBMEC中P190蛋白的表達(dá)信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理HBMEC后，加EGF處理HBMEC，相應(yīng)時(shí)間后收取蛋白樣品，western blot檢測(cè)HBMEC中P190蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)表明JNK的

9、抑制劑SP600125可以明顯阻斷EGF使HBMEC中P190蛋白升高，其他抑制劑沒有明顯變化，說(shuō)明JNK信號(hào)通路可能是參與調(diào)控的主要信號(hào)通路。
　　三、EGF對(duì)HBMEC血管形成能力無(wú)明顯影響，對(duì)HBMEC通透性的影響與P190蛋白胞內(nèi)段缺失的HBMEC的通透性影響相同
　　50ng/ml的EGF處理HBMEC組與HBMEC對(duì)照組間血管生成試驗(yàn)沒有明顯影響。50ng/ml的EGF處理HBMEC后與HBMEC對(duì)照組Trans