梅毒螺旋體體外活化人腦微血管內(nèi)皮細胞的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 梅毒螺旋體粘附于人腦微血管內(nèi)皮細胞的實驗研究
　　目的:觀察梅毒螺旋體與體外培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)的粘附方式和粘附規(guī)律。
　　方法:將HBMEC接種于含細胞爬片的24孔細胞培養(yǎng)板中，加入8×106條/ml的梅毒螺旋體懸液共培養(yǎng)，分別于0.5、2、4h后使用掃描電鏡分析梅毒螺旋體與HBMEC的粘附方式;加不同濃度（4×106條/ml、8×106條/ml、1.

2、6×107條/ml）梅毒螺旋體懸液共培養(yǎng)，分別于2、4、6、16h后運用暗視野顯微鏡計數(shù)單個HBMEC上粘附的梅毒螺旋體數(shù)量。實驗數(shù)據(jù)用重復(fù)測量資料的方差分析進行分析。
　　結(jié)果:掃描電鏡結(jié)果顯示梅毒螺旋體集中粘附于HBMEC膜表面的某些區(qū)域，兩者在粘附的部位可發(fā)生融合。時間與濃度間存在交互作用(F=98.74，P＜0.001)，在各濃度組，不同時間點細胞上粘附的螺旋體數(shù)目間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=387.72，P＜0.001)

3、，粘附的螺旋體數(shù)量隨著共培養(yǎng)時間的延長而逐漸增多，4h時達到高峰，然后逐漸降低。在4h時，不同濃度組間細胞上粘附的螺旋體數(shù)目間的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=593.23，P＜0.001)。
　　結(jié)論:梅毒螺旋體可以粘附于體外培養(yǎng)的HBMEC，梅毒螺旋體可能是通過菌體尖端與細胞膜溶解的方式與HBMEC粘附;1.6×107條/ml和共培養(yǎng)4h分別是梅毒螺旋體與HBMEC粘附的最佳濃度和時間。
　　第二部分 梅毒螺旋體刺激后人腦微血

4、管內(nèi)皮細胞基因表達譜分析及差異表達基因的功能分析
　　目的:探討梅毒螺旋體粘附對人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)基因表達譜的影響，分析差異表達基因的功能，從mRNA水平了解HBMEC對梅毒螺旋體的反應(yīng)。
　　方法:構(gòu)建HBMEC單層模型，加入1.6×107條/ml的梅毒螺旋體懸液，以未加螺旋體的HBMEC作為對照，4h后提取細胞RNA，利用Agilent SurePrint G3Human Gene Expression M

5、icroarray(8×60K)基因芯片檢測HBMEC的基因表達譜，篩選差異表達基因。利用GO和KEGG富集法分析差異表達基因的功能，利用qRT-PCR對7個感興趣的差異表達基因進行驗證。
　　結(jié)果:基因芯片共篩選出249個差異表達的基因，包括218個上調(diào)表達的基因和31個下調(diào)表達的基因。GO富集分析結(jié)果顯示差異表達基因共參與38個GOterms，其中生物學(xué)過程、分子功能、細胞成分的terms數(shù)目分別為27、6和5，內(nèi)皮細胞活化、

6、宿主細胞免疫反應(yīng)和細菌粘附等多個生物學(xué)過程。KEGG富集分析結(jié)果顯示差異表達基因富集于12條信號通路中，兩者相互作用過程可能涉及Th17 cell differentiation通路和Cell adhesion molecules通路。qRT-PCR結(jié)果顯示RARRES2、ADAMTS5、F3、MACF1和DCN表達上調(diào)，CLDN4和LDLR表達下調(diào)，與基因芯片結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論:梅毒螺旋體可改變HBMEC的基因表達譜，差異

7、表達基因廣泛參與多個生物學(xué)過程。梅毒螺旋體粘附后的HBMEC被激活，同時發(fā)起一系列免疫防御對抗螺旋體的侵襲。該基因芯片分析結(jié)果為進一步研究人腦微血管內(nèi)皮細胞在神經(jīng)梅毒發(fā)病機制中的作用提供新的平臺和研究方向。
　　第三部分 梅毒螺旋體對人腦微血管內(nèi)皮細胞中多個趨化因子配體表達的影響
　　目的:探索梅毒螺旋體對HBMEC中趨化因子配體(CXCL)表達的影響。
　　方法:將HBMEC接種于6孔或96孔細胞培養(yǎng)板中，分為梅毒螺

8、旋體組、滅活梅毒螺旋體、脂多糖組和空白對照組，分別加入梅毒螺旋體、滅活的梅毒螺旋體、脂多糖和細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，于6、12、24h后分別用熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細胞中CXCL-6、CXCL-8、CXCL-10和CXCL-13的基因表達水平和蛋白表達水平。利用Transwell小室細胞遷移實驗檢測梅毒螺旋體刺激后HBMEC對人早幼粒細胞白血病細胞(HL-60)的趨化作用。
　　結(jié)果:在各時間點，梅毒螺旋體組中CXCL-6、

9、CXCL-8和CXCL-10的mRNA表達水平均顯著高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組（均P＜0.05），而滅活梅毒螺旋體組與空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。各組細胞中CXCL-13的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在各時間點，梅毒螺旋體組中CXCL-6和CXCL-8的含量均高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組(均P＜0.05)，而滅活梅毒螺旋體組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）;在各時間點，梅毒螺旋體組細胞