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文檔簡介
1、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)是主要分布于上皮細胞表面的I型跨膜糖蛋白,它不僅參與形成細胞間粘附連接(adherens junctions,AJs)、維持細胞極性和組織完整性,更重要的是它將細胞外信息傳導入細胞內,介導細胞間的信息傳遞。E-鈣粘蛋白能有效地抑制腫瘤細胞的增殖和轉移,大量文獻證實,許多惡性腫瘤的發(fā)生都伴有E-鈣粘蛋白表達降低或功能缺失,因此E-鈣粘蛋白被認為是一種重要的腫瘤抑制分子。 E-鈣粘蛋白主要由胞外、
2、跨膜及胞內肽段三部分組成。由人E-鈣粘蛋白氨基酸序列推測(Gene Bank Accession No.L08599),E-鈣粘蛋白胞外肽段存在四個潛在的N-糖基化位點(N-X-S/T),分別位于Asn 554、Asn 566、Asn 618及Asn 633(N554、N566、N618及N633)。雖然E-鈣粘蛋白在介導鈣離子依賴的細胞間粘附、抑制腫瘤發(fā)展方面具有重要的生物學功能,但是至今我們對其N-糖基化結構及功能的了解并不深入。
3、 為了深入闡明E-鈣粘蛋白N-糖基化的結構及功能,實驗室前期,分別或聯(lián)合地將這四個潛在N-糖基化位點的一致性序列(NXS/T)中的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨0?,構建了一系列缺失E-鈣粘蛋白不同位點N-糖基化的突變E-鈣粘蛋白真核基因表達質粒,并將這些質粒轉染入本身不表達E-鈣粘蛋白的高侵襲性乳腺癌細胞MDA-MB-435中,篩選后獲得八株穩(wěn)定表達細胞株。前期實驗還發(fā)現(xiàn),N633位點的N-糖基化似乎對于E-鈣粘蛋白的穩(wěn)定表達至關重要,去除
4、這一位點的N-糖基化,E-鈣粘蛋白在蛋白水平不能夠表達。 如前所述,人E-鈣粘蛋白胞外肽段存在四個潛在的N-糖基化位點,由于糖蛋白并非每個潛在N-糖基化位點都一定發(fā)生N-糖基化修飾, 本文的第一部分首先鑒定E-鈣粘蛋白四個潛在N-糖基化位點是否存在N-糖基化,并應用質譜技術及糖苷酶酶切的方法初步了解N-糖鏈的結構。研究發(fā)現(xiàn),E-鈣粘蛋白四個潛在的N-糖基化位點都存在N-糖基化修飾,而且這四個位點的N-糖鏈可能都是復雜型N
5、-糖鏈。 有文獻報道,N-糖基化的異常修飾可能影響鈣粘蛋白介導的細胞粘附。高爾基體內的糖基轉移酶N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶V(GnT-V)過表達,催化N-鈣粘蛋白使其β1-6分支的N-糖鏈結構增加,N-鈣粘蛋白介導的細胞粘附能力明顯下降;而高爾基體內另外一種與GnT-V有競爭性的糖基轉移酶N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶Ⅲ(GnT-Ⅲ)過表達,催化E-鈣粘蛋白使其平分型的N-乙酰氨基葡萄糖鏈結構增加時,E-鈣粘蛋白介導的細胞粘附能力增加。
6、這些研究結果提示,N-糖基化結構的改變可能影響鈣粘蛋白介導的細胞粘附,但N-糖基化如何影響E-鈣粘蛋白介導的細胞粘附及其分子機制目前并沒有報道。 本文的第二部分系統(tǒng)研究這一問題。 應用細胞聚集實驗我們發(fā)現(xiàn),E-鈣粘蛋白N554、N566兩個位點的N-糖基化顯著影響E-鈣粘蛋白的細胞粘附功能,去除這兩個位點N-糖基化細胞粘附能力顯著下降伴而遷移能力增加;而N618位點的N-糖基化似乎對于E-鈣粘蛋白的粘附功能及細胞的遷移能
7、力沒有顯著影響。在本文第三部分研究中,我們進一步探討了N-糖基化影響E-鈣粘蛋白細胞粘附功能的分子機制。我們首先應用放線菌酮初步分析N-糖基化對蛋白穩(wěn)定性的影響。 研究發(fā)現(xiàn),與N633位點顯著影響蛋白穩(wěn)定性不同,N554、N566和N618位點的N-糖基化基本不影響蛋白穩(wěn)定表達。免疫熒光及Triton X-100抽提實驗證實,這三個位點的N-糖基化也并不影響E-鈣粘蛋白在細胞表面及細胞粘附連接處(adherens junctio
8、ns,AJs)的表達,這樣的結果說明,N-糖基化并非通過影響E-鈣粘蛋白穩(wěn)定性或E-鈣粘蛋白在細胞粘附連接處的表達進而影響細胞粘附。那么,N-糖基化如何影響E-鈣粘蛋白的粘附功能呢?我們隨后的研究發(fā)現(xiàn),去除E-鈣粘蛋白N554,N566和N618位點的N-糖基化會引起β-連環(huán)蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高。而β-連環(huán)蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高往往會導致E-鈣粘蛋白/β-連環(huán)蛋白復合物解體。接下來,通過對細胞粘附連接復合物進行分析,我們發(fā)現(xiàn),
9、去除E-鈣粘蛋白N554、N566和N618位點N-糖基化后細胞粘附連接處β-連環(huán)蛋白及a-連環(huán)蛋白含量明顯下降。因此我們得出結論,E-鈣粘蛋白N554、N566和N618位點的N-糖基化通過影響β-連環(huán)蛋白的酪氨酸磷酸化水平,調節(jié)細胞粘附連接復合物中β-,a-連環(huán)蛋白的含量,最終影響細胞與細胞之間的粘附能力。 作為重要腫瘤抑制分子,E-鈣粘蛋白能有效地抑制腫瘤細胞的增殖和轉移,影響腫瘤的惡性行為。那么N-糖基化是否參與E-鈣粘
10、蛋白對腫瘤細胞生物學行為的影響?在本文第四部分的研究中,我們探討了E-鈣粘蛋白N-糖基化對細胞周期進程的影響。研究發(fā)現(xiàn),在MDA-MB-435細胞中,野生型E-鈣粘蛋白能夠抑制周期蛋白cyclin Dl的表達,抑制細胞由Gl向S期轉化,導致細胞出現(xiàn)Gl期阻滯;然而,隨后的實驗發(fā)現(xiàn)N554、N566及N618位點N-糖基化對于E-鈣粘蛋白對細胞Gl/S轉化的抑制效應是十分關鍵的,一旦去除這三個位點N-糖基化,突變E-鈣粘蛋白似乎不能夠抑制
11、MDA—MB-435細胞由G1期向S期的轉化。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白這三個位點的N-糖基化通過細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號通路影響了MDA-MB-435細胞Gl/S期的轉化。值得注意的是,N554、566兩個位點的N-糖基化,尤其前者,顯著影響E-鈣粘蛋白對Gl/S轉化的抑制。本論文研究發(fā)現(xiàn),不同位點N-糖基化對E-鈣粘蛋白穩(wěn)定性及生物學功能的影響不
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