鈣敏感受體在胃癌發(fā)生發(fā)展和十二指腸HCO3-分泌中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　鈣是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與了眾多病理生理過程的調(diào)控。G蛋白偶聯(lián)受體C家族的鈣敏感受體(CaSR)作為體內(nèi)鈣平衡重要的調(diào)節(jié)器，在整個(gè)消化系統(tǒng)均有表達(dá)，并且也在胃腸道生理功能和疾病進(jìn)程中扮演著重要角色。目前有研究報(bào)道CaSR能通過鈣信號(hào)途徑影響胃酸、胰島素分泌及營養(yǎng)吸收等生理過程;而高鈣飲食可以激活CaSR，不但能抑制結(jié)腸癌的發(fā)展，還可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性;同時(shí)CaSR也在治療腹瀉疾病和結(jié)石相關(guān)性胰腺炎中具

2、有潛在的調(diào)控作用。然而CaSR在胃腸道的功能及調(diào)控機(jī)制仍有很多盲區(qū)。眾所周知消胃腸道腫瘤及消化性潰瘍都是消化系統(tǒng)常見病。胃腸道腫瘤發(fā)病率高，且侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，多年來人們一直致力消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及后期浸潤、轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究，但仍有許多問題仍不十分清楚;而消化性潰瘍的復(fù)發(fā)與遷延不愈同樣也是臨床上治療的一個(gè)難點(diǎn)。既往研究證實(shí)CaSR在不同的腫瘤中作用不同，而消化系統(tǒng)中僅在大腸癌中報(bào)道其作為抑癌因素，同時(shí)CaSR對(duì)胰腺碳酸氫鹽(HCO

3、3-)分泌的促進(jìn)作用提示其可能也參與了十二指腸粘膜屏障的維護(hù)，因此本研究希望從消化生理和病理兩方面，探討鈣敏感受體及其下游的鈣信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展及十二指腸碳酸氫鹽分泌中的作用及其相關(guān)機(jī)制，為以鈣敏感受體及離子通道為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分:鈣敏感受體(CaSR)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究
　　1、采用Real-time PCR、免疫組化及Western-blot技術(shù)檢測(cè)胃

4、癌及癌旁組織、正常胃粘膜永生化細(xì)胞系及胃癌細(xì)胞系中CaSR的表達(dá)，分析統(tǒng)計(jì)CaSR表達(dá)水平和臨床分期、分型、血鈣水平及預(yù)后的相關(guān)性;
　　2、采用CCK8增殖測(cè)定實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞平面劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)以及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)外水平共同驗(yàn)證CaSR對(duì)胃癌細(xì)胞行為影響;
　　3、動(dòng)態(tài)離子測(cè)定成像系統(tǒng)檢測(cè)正常胃粘膜永生細(xì)胞與胃癌細(xì)胞CaSR活化后調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+及胃酸H+分泌能力的差異，從功能角度揭示CaSR從

5、正常向胃癌發(fā)展中的角色轉(zhuǎn)變;
　　4、Western-bolt技術(shù)檢測(cè)正常胃粘膜永生細(xì)胞與胃癌細(xì)胞CaSR活化后下游相關(guān)信號(hào)通路變化的差異，篩選最為重要的信號(hào)通路及靶基因。
　　第二部分:鈣敏感受體(CaSR)通過Ca2+調(diào)控途徑促進(jìn)十二指腸離子轉(zhuǎn)運(yùn)及HCO3-分泌的研究
　　1、Western-blot和免疫組化技術(shù)檢測(cè)CaSR在小鼠十二指腸組織及細(xì)胞系的表達(dá)及分布情況;
　　2、動(dòng)態(tài)離子測(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)CaSR對(duì)

6、十二指腸上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化及HCO3-分泌的影響;
　　3、通過各種離子通道抑制劑從細(xì)胞水平驗(yàn)證參與CaSR調(diào)控HCO3-分泌的功能機(jī)制及下游相關(guān)通路。
　　結(jié)果:
　　第一部分:鈣敏感受體(CaSR)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究
　　1、Western-blot，Real-time PCR和免疫組化結(jié)果證實(shí)CaSR在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常胃粘膜永生化細(xì)胞系，并且CaSR的表

7、達(dá)量與胃癌大小和分化程度、分期均有相關(guān)性（p＜0.05）;
　　2、臨床資料統(tǒng)計(jì)胃癌病人血液中的鈣離子濃度與CaSR蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，生存分析表明CaSR低表達(dá)組的胃癌患者術(shù)后生存時(shí)間優(yōu)于CaSR高表達(dá)組（p＜0.01），提示CaSR與胃癌病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性;
　　3、激活CaSR能促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN45、SGC-7901的增殖、遷移及侵襲能力(P＜0.05)，并且這種促癌能力與CaSR的表達(dá)水平呈正相關(guān)。雖然CaSR對(duì)

8、正常胃粘膜永生細(xì)胞GES-1細(xì)胞也有一定的促遷移作用，但對(duì)增殖無明顯影響，CaSR的抑制劑NPS2143及CaSR shRNA能逆轉(zhuǎn)CaSR對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的促進(jìn)作用(p＜0.05);
　　4、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)CaCl2瘤內(nèi)注射激活CaSR，可以促進(jìn)裸鼠皮下腫瘤的生長，而CaSR抑制劑NPS2143能夠阻斷CaSR的促成瘤作用（p＜0.05）;
　　5、功能機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)GES-1正常胃粘膜永生細(xì)胞、MKN45及

9、SGC-7901胃癌細(xì)胞的CaSR均能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣增加，并且胃癌細(xì)胞MKN45及SGC-7901細(xì)胞內(nèi)鈣升高的幅度較正常胃粘膜永生細(xì)胞GES-1明顯上升，提示正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間CaSR的鈣調(diào)控能力及途徑存在差異(p＜0.001); CaSR抑制劑NPS2143及CaSR shRNA能阻斷MKN45胃癌細(xì)胞CaSR活化引起的細(xì)胞內(nèi)鈣變化（p＜0.05）;
　　6、無外鈣環(huán)境中CaSR的活化并不能引起細(xì)胞內(nèi)鈣變化，必須在有鈣環(huán)境中C

10、aSR才能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣水平，膜上鈣通道阻斷劑2-APB和PLC途徑阻斷劑均能完全阻斷CaSR對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響，提示參與CaSR調(diào)控胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣增加的主要機(jī)制是外鈣內(nèi)流途徑（p＜0.05）;
　　7、分子機(jī)制研究證實(shí)，同時(shí)激活GES-1正常胃粘膜永生細(xì)胞和MKN45、SGC-7901胃癌細(xì)胞的CaSR，下游MAPK(ERK1/2/JNK)信號(hào)通路均在5-10min明顯活化，但PI3K/AKT和Wnt/β-catenin通路的變化卻出

11、現(xiàn)了差異， GES-1細(xì)胞的PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號(hào)通路被逐漸抑制，而MKN45、SGC-7901細(xì)胞卻明顯活化，提示正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間上述兩條通路的變化存在差異，并且可能與細(xì)胞內(nèi)鈣變化幅度的不同相關(guān);
　　8、細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM能完全阻斷CaSR對(duì)PI3K/AKT和Wnt/β-catenin以及MAPK信號(hào)通路的活化作用，提示Ca2+信號(hào)的確是精確調(diào)控上述通路的關(guān)鍵因素;PI3K/AKT、W

12、nt/β-catenin的抑制劑和細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM均能逆轉(zhuǎn)CaSR促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的能力;
　　第二部分:鈣敏感受體(CaSR)通過Ca2+調(diào)控途徑促進(jìn)十二指腸離子轉(zhuǎn)運(yùn)及HCO3-分泌的研究
　　1、免疫組化及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)C57BL/6小鼠十二指腸組織、狗的十二指腸上皮細(xì)胞SCBN以及人的大腸癌細(xì)胞SW480、Caco-2均有CaSR表達(dá)，十二指腸組織主要在絨毛上皮頂端及基底部廣泛表達(dá)，進(jìn)一

13、步亞細(xì)胞定位是在細(xì)胞的胞漿、胞膜區(qū)域;
　　2、功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)十二指腸上皮細(xì)胞SCBN的CaSR能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣增加，并且增加的幅度與激動(dòng)劑的刺激濃度呈劑量依賴性(p＜0.01）。CaSR阻斷劑Calhex后能明顯阻斷CaSR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣變化(p＜0.05）;
　　3、無外鈣環(huán)境中激活SCBN細(xì)胞的CaSR并不能引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加，必須在有鈣環(huán)境中CaSR才能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣水平，膜上鈣通道阻斷劑2-APB和SKF能完全阻斷CaS

14、R對(duì)SCBN細(xì)胞內(nèi)鈣的影響，提示CaSR對(duì)SCBN細(xì)胞的鈣調(diào)控機(jī)制是通過外鈣內(nèi)流途徑是(p＜0.05);
　　4、進(jìn)一步單細(xì)胞HCO3-動(dòng)態(tài)測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SCBN細(xì)胞的CaSR可以通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣變化，調(diào)控HCO3-分泌通道CFTR的開放促進(jìn)了HCO3-的跨膜流動(dòng)，CFTR阻斷劑CFTR-173及膜上Ca2+通道阻斷劑2-APB均能阻斷CaSR對(duì)HCO3-跨膜流動(dòng)的促進(jìn)作用（p＜0.01）;
　　5、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CaS

15、R的活化對(duì)CFTR野生型小鼠的十二指腸粘膜HCO3-分泌具有促進(jìn)作用(p＜0.01)，但對(duì)CFTR敲除小鼠HCO3-的分泌沒有影響，另外對(duì)代表Cl-通道活性的Isc值也沒有調(diào)控作用(p＞0.05); PLC-Ca2+途經(jīng)抑制劑U73122可以明顯阻斷CaSR對(duì)CFTR野生型小鼠HCO3-的促分泌作用（p＜0.01）;
　　結(jié)論:
　　1、本研究首次證實(shí)了CaSR在胃癌發(fā)生發(fā)展中的促癌作用及其相關(guān)機(jī)制，CaSR通過膜上鈣通道介

16、導(dǎo)了胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，進(jìn)而激活下游的PI3K/AKT和3-catenin信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。并且CaSR的表達(dá)水平及其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣變化幅度是調(diào)控胃癌細(xì)胞行為及其下游信號(hào)通路活化差異的重要因素。我們的結(jié)果不僅為臨床上高鈣血癥的不良預(yù)后給出了可能的解釋，同時(shí)也為低鈣補(bǔ)液、低鈣飲食防治胃癌的理論和以CaSR為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù);
　　2、我們生理功能的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaSR具有促進(jìn)十二指腸HCO3-的分

17、泌、幫助粘液屏障構(gòu)建的重要作用。十二指腸上皮細(xì)胞的CaSR通過鈣調(diào)控途徑，不僅激活了HCO3-分泌通道CFTR，同時(shí)還活化了為HCO3-分泌提供驅(qū)動(dòng)力IKCa（Ca2+激活鉀通道）通道共同促進(jìn)HCO3-的分泌，而Cl-通道沒有受CaSR/Ca2+途徑的調(diào)控，推測(cè)十二指腸上皮HCO3-與Cl-的分泌存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。該研究不僅有助于治療囊性纖維化病人HCO3-的分泌缺失，還可能為以CaSR和離子通道為靶點(diǎn)的粘膜屏障促進(jìn)藥物提供一定的理論