尿液lncRNA在前列腺癌早期診斷以及新型miRNA在進展機制中的研究.pdf

1、中國前列腺癌(Prostate cancer，PCa)的發(fā)病率和死亡率急劇上升，其增長率位居腫瘤之首。同時，PCa的防治面臨著兩大臨床難題，即早期診斷指標特異性差和晚期治療方法效果不佳。因此，臨床上亟需找到新型的敏感性和特異較高的PCa診斷標志物或診斷策略來代替血清PSA或彌補血清PSA在早期診斷上的不足；基礎研究上亟需闡明PCa進展的關鍵分子機制，從而研發(fā)出抑制去勢抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prosta

2、te cancer，CRPC)的新型藥物，實現(xiàn)CRPC治療上的突破。
　　研究目的:
　　研究尿液中長鏈非編碼RNA MALAT1和PCA3評分在前列腺初次穿刺患者中的診斷作用，建立基于尿液MALAT1或PCA3評分的綜合診斷模型；探索新型miR-n5在PCa進展中的作用機制，尋找CRPC干預的新靶點。
　　研究方法:
　　全轉錄組擴增試劑盒擴增尿沉渣RNA，qRT-PCR檢測MALAT1和PCA3的表達，單因素

3、logistic回歸預測PCa的危險因素，多因素logistic回歸建立PCa診斷模型，Spearman rank檢測分析尿液MALAT1或PCA3評分與其它臨床變量之間的關系，運用受試者工作曲線(Receiver operating characteristic curve，ROC)確定診斷指標的曲線下面積（Area under the ROC，AUC）、最佳截斷值、特異度和敏感度，決策曲線分析(Decision curve anal

4、ysis，DCA)來估算尿液MALAT1和PCA3評分的臨床價值。Northern blot檢測新型miRNA的存在與表達，細胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成實驗來評價miR-n5在進展性PCa細胞系中的生物學功能，生物信息學軟件預測miR-n5的靶基因，雙熒光素酶報告基因法驗證靶基因，GraphPad Prism5進行數(shù)據(jù)展示并計算藥物的IC50，皮下種植和脛骨內注射建立CRPC小鼠移植瘤模型。用SPSS v.17.0(SPSS Inc.

5、，Chicago, IL, USA), MedCalc v.10.4.7.0(MedCalc Software bvba, Mariakerke, Belgium)和R軟件包v.3.1.1(The R Foundation for Statistical Computing)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，運用HemI軟件進行數(shù)據(jù)的Heatmap分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果:
　　尿液MALAT1和PCA3評

6、分可以明確區(qū)分腫瘤組和穿刺陰性組患者并與PCa的檢出率高度相關，但進一步的相關性分析發(fā)現(xiàn)，尿液MALAT1和PCA3評分與臨床危險因素以及Gleason評分沒有相關性。年齡、血清總PSA(Total PSA，tPSA)、前列腺體積(Prostate volume，PV)、游離PSA比值（Percentage of free PSA，％fPSA）和直腸指診結果（Digital rectal examination，DRE）是總體人群的獨立

7、預測因子，而在PSA=4-10ng/ml（PSA“診斷灰區(qū)”）人群中，年齡、PV、％fPSA和DRE是其獨立預測因子。尿液MALAT1評分在總體人群中的PCa診斷效能與tPSA相比雖然稍高但沒有統(tǒng)計學意義(p=0.510)，但在PSA“診斷灰區(qū)”人群中則明顯優(yōu)于tPSA(p=0.034)。PCA3評分在PSA“診斷灰區(qū)”人群中的PCa診斷效能則明顯優(yōu)于tPSA(p=0.0407)和％fPSA(p=0.046)。進一步的logistic回

8、歸分析得出，在發(fā)現(xiàn)組的PSA“診斷灰區(qū)”人群中，基于尿液MALAT1評分綜合模型的預測準確性為79.79％和AUC為0.853，預測準確性比基礎模型提高了5.32％，AUC提高了0.0318。將這一模型應用到驗證組也得到了相同的結果。同樣，在PSA“診斷灰區(qū)”人群中，基于尿液PCA3評分綜合模型的AUC也高達0.819，高于基礎模型的0.788。
　　應用DCA，在PSA“診斷灰區(qū)”人群中，不管是在發(fā)現(xiàn)組還是在驗證組，基于尿液MA

9、LAT1評分綜合模型的臨床預測能力都優(yōu)于基礎模型。將臨床穿刺風險定為25％，發(fā)現(xiàn)組人群中基于尿液MALAT1評分綜合模型的總獲益率高于基礎模型(13.97％ vs.11.47％)，且可以避免更多不必要的前列腺穿刺(47.32％ vs.39.78％)；驗證組人群基于尿液MALAT1評分綜合模型的總獲益率同樣高于基礎模型(15.73％ vs.13.11％)，且可以避免更多不必要的前列腺穿刺(30.33％ vs.22.47％)，更為重要的是，

10、綜合模型沒有漏診1例高級別PCa而基礎模型則漏診1例高級別PCa。同樣，在PSA“診斷灰區(qū)”人群中，基于PCA3評分綜合模型幾乎在所有臨床穿刺閾值上優(yōu)于基礎模型，特別是在25％-40％這一區(qū)間顯示出了更好的預測作用。應用30％這一臨床穿刺閾值，基于PCA3綜合模型可以避免60.3％不必要的穿刺活檢，但以漏診4例PCa為代價，其中2例為高級別PCa。
　　此外，應用65對PCa及其癌旁正常組織進行RNA-seq發(fā)現(xiàn)300多個新型mi

11、RNA，并使用Northern blot驗證了其中表達量最高的8個新型miRNA。通過在進展性PCa與惰性PCa細胞系中的表達情況比較，篩選出4個與PCa進展相關的新型miRNA。再通過臨床樣本的驗證，最終選取miR-n5作為后續(xù)的研究對象。體外的功能實驗表明，miR-n5能夠明顯抑制進展性PCa細胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成能力，說明miR-n5的缺失或低表達可能促進了PCa的進展。進一步的體內實驗證明了腫瘤內注射miR-n5能夠抑

12、制小鼠移植瘤的生長。此后，生物信息學分析并找到了miR-n5的作用靶基因KDM6B，同時，通過雙熒光素酶報告基因及qRT-PCR進行驗證。進一步的研究表明，KDM6B的特異性抑制劑——小分子化合物GSK-J4能夠抑制KDM6B的活性并明顯抑制PCa細胞的生長，體內實驗也證明了這一小分子化合物能夠明顯抑制小鼠移植瘤的生長。
　　研究結論:
　　尿液MALAT1和PCA3是PCa的獨立預測因子，能明確區(qū)分前列腺穿刺陽性和陰性患者

13、，基于尿液MALAT1或PCA3建立的臨床綜合診斷模型可大大提高PCa的臨床診斷效能。尤其在PSA“診斷灰區(qū)”，尿液MALAT1和PCA3的診斷效能明顯高于血清總PSA，基于尿液MALAT1或PCA3建立的臨床綜合診斷模型的預測能力高于應用臨床危險因素建立的基礎模型，并能夠避免更多不必要的前列腺穿刺且不會漏診更多的高級別PCa。此外，本研究證明了miR-n5在體內和體外都能明顯抑制進展性PCa的生長，它通過抑制其靶基因KDM6B的表達發(fā)