GOLPH3在前列腺癌演進中的功能及機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 前列腺癌是歐美國家男性患者中最常見的惡性腫瘤，影響著美國約1/6男性的健康。近年來隨著人們生活方式的改變、壽命的延長及醫(yī)療保健水平的提高，我國前列腺癌發(fā)病率呈顯著增長趨勢。
　　 早在1941年，芝加哥大學(xué)Ben May癌癥研究實驗室研究員Huggins和Hodges證實了前列腺細(xì)胞在無雄激素持續(xù)刺激時將會發(fā)生凋亡，開創(chuàng)了腫瘤內(nèi)分泌治療的先河。前列腺癌內(nèi)分泌治療的目的是降低體內(nèi)雄激素水平、抑制睪酮轉(zhuǎn)化

2、為雙氫睪酮或阻斷雄激素與其受體結(jié)合，以抑制或控制前列腺癌細(xì)胞生長。隨著對腫瘤病理生理學(xué)的進一步認(rèn)識，前列腺癌內(nèi)分泌治療已由早期的姑息治療發(fā)展為臨床的主要治療手段之一。雖然多數(shù)前列腺癌患者在首次接受內(nèi)分泌治療后都有顯著療效，但超過一半的患者最終都會復(fù)發(fā)并由激素依賴性前列腺癌(Hormone-Dependent Prostate Cancer，HDPC)進展為激素非依賴型前列腺癌(Hormone-Independent Prostate C

3、ancer，HIPC)，表現(xiàn)為前列腺癌細(xì)胞的增殖失去調(diào)控，PSA進行性升高，極易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，而且轉(zhuǎn)變后的治療非常棘手，死亡率極高。
　　 揭示前列腺癌由雄激素依賴向雄激素非依賴性演進的發(fā)生機制，是預(yù)防和治療前列腺癌的關(guān)鍵。盡管關(guān)于前列腺癌生物學(xué)行為及其機制的研究有眾多的文獻(xiàn)報道，目前也還沒有一個系統(tǒng)完整的解釋，但很明顯，和大多數(shù)腫瘤一樣，前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多因素多基因多步驟的過程。因此發(fā)現(xiàn)和鑒定引起前列腺癌激素非依賴性

4、演進的關(guān)鍵基因及信號分子，并以這些關(guān)鍵基因及信號分子為靶點，研究能阻止前列腺癌細(xì)胞向雄激素非依賴性轉(zhuǎn)化的可能機制，有可進一步促進前列腺癌治療技術(shù)的發(fā)展。
　　 定位于染色體5p13的Golgi phosphorprotein-3(GOLPH3)基因，是一種磷酸化的高爾基體膜蛋白，參與執(zhí)行高爾基體的蛋白質(zhì)分選功能。直到2009年6月Nature雜志發(fā)表的Lynda Chin教授的文章首次表明，GOLPH3是第一個被發(fā)現(xiàn)的定位于反面

5、高爾基網(wǎng)的具有強大轉(zhuǎn)化能力的癌基因。但對GOLPH3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制的研究剛剛起步。本研究重點在于闡明GOLPH3基因與前列腺癌演進的相關(guān)性，并探討其可能的信號網(wǎng)絡(luò)途徑。
　　 方法：
　　 1.檢測GOLPH3在全身正常組織（包括前列腺）及其相關(guān)病變中的表達(dá)
　　 1.1 檢測GOLPH3在全身正常組織及其惡性腫瘤中的表達(dá)應(yīng)用免疫組化EliVision法，檢測28例肺腺癌、胃腺癌、結(jié)腸腺癌

6、、肝細(xì)胞性肝癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、睪丸精原細(xì)胞瘤標(biāo)本及其配對的正常組織中GOLPH3的表達(dá)。
　　 1.2 檢測GOLPH3在前列腺及其相關(guān)病變組織中的表達(dá)應(yīng)用免疫組化EliVision法，檢測139例(36.48％) HDPC，102例(26.77％)HIPC，21例HIPC骨轉(zhuǎn)移灶，61例(16.01％)高級別前列腺上皮內(nèi)瘤(High-gradeProstatic Intraepithelial Neopla

7、sia，HGPIN)，20例(5.25％)良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia，BPH)，20例(5.25％)正常前列腺組織中GOLPH3的表達(dá)。
　　 2.GOLPH3基因沉默對前列腺細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 2.1 Real-time-PCR檢測GOLPH3基因在4種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞株Du145、PC-3、LNcap和BPH中的表達(dá)。
　　 2.2 Western blot

8、及免疫熒光染色檢測GOLPH3及Androgen Receptor(AR)蛋白在4種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞株Du145、PC-3、LNcap和BPH中的表達(dá)。
　　 2.3 構(gòu)建穩(wěn)定沉默內(nèi)源性GOLPH3的前列腺癌細(xì)胞株設(shè)計GOLPH3干擾片段，構(gòu)建含U6啟動子的慢病毒載體，將慢病毒載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT病毒包裝細(xì)胞，收集病毒上清，進行病毒滴度測定，用慢病毒感染DU145細(xì)胞，RT-PCR和Western blot鑒定有效

9、的干擾載體。
　　 用含GOLPH3特異性干擾片段的慢病毒感染DU145/EGFP+細(xì)胞，用含空載體的病毒做對照。用殺稻瘟菌素篩選抗性克隆，挑取抗性單克隆，熒光定量PCR和Western blot鑒定干擾后GOLPH3基因在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2.4 GOLPH3表達(dá)沉默對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響流式細(xì)胞儀檢測沉默內(nèi)源性GOLPH3對前列腺癌細(xì)胞生長周期及凋亡的影響;MTT法檢測細(xì)胞體外生長曲線;平板克隆形成實驗檢

10、測沉默內(nèi)源性GOLPH3對前列腺癌細(xì)胞體外克隆形成能力的影響;軟瓊脂集落形成實驗檢測GOLPH3對前列腺癌細(xì)胞錨定非依賴生長能力的影響;Ki-67免疫組化檢測沉默內(nèi)源性GOLPH3對前列腺癌細(xì)胞增殖指數(shù)的影響;三維細(xì)胞培養(yǎng)實驗和小室侵襲實驗檢測沉默內(nèi)源性GOLPH3表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞體外侵襲能力的影響;Transwell小室檢測沉默內(nèi)源性GOLPH3表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞體外運動遷移能力的影響;平板劃痕愈合實驗檢測沉默內(nèi)源性GOLPH3表達(dá)

11、對前列腺癌細(xì)胞體外運動能力的影響。
　　 3.利用基因芯片技術(shù)初步探討GOLPH3促進前列腺癌演進的分子機制
　　 3.1 Roche NimbleGen真核生物表達(dá)譜芯片檢測GOLPH3基因表達(dá)沉默前后差異基因表達(dá)譜，并進行差異表達(dá)基因的GO功能分析和生物學(xué)信號通路分析。
　　 3.2 熒光定量PCR方法驗證芯片差異基因的表達(dá)。
　　 3.3 免疫組化檢測差異基因在Du145/GFP+/GOLPH3-和

12、Du145/GFP+/mock細(xì)胞以及前列腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.GOLPH3在正常組織及多種惡性腫瘤中的表達(dá)GOLPH3蛋白在全身多器官正常組織中低表達(dá)，在部分實體惡性腫瘤組織中，GOLPH3的表達(dá)明顯升高，包括胃腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、睪丸精原細(xì)胞瘤及子宮內(nèi)膜樣腺癌等，在結(jié)腸腺癌等GOLPH3的表達(dá)未見明顯升高。
　　 2.GOLPH3在正常前列腺、前列腺增生、前

13、列腺上皮內(nèi)瘤變及前列腺癌等組織中的表達(dá)在正常前列腺組織及BPH、HGPIN、HDPC、HIPC及其骨轉(zhuǎn)移灶組織中，GOLPH3均不同程度的表達(dá)，正常前列腺及BPH、HGPIN組織中GOLPH3主要呈弱陽性表達(dá)，陽性率分別為90％、95％、93.44％，HDPC組織中GOLPH3主要呈弱陽性表達(dá)，陽性率為85.61％，正常前列腺、BPH、HGPIN與HDPC間GOLPH3的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.743);在正常前列腺、BPH、HG

14、PIN及HDPC組織中，GOLPH3中到強陽性(++/+++)表達(dá)的陽性率分別為5％(1/20)、5％(1/20)、4.92％(3/61)和10.79％(15/139);在HIPC組織中，GOLPH3主要呈中到強陽性(++/+++)表達(dá)，陽性率為81.37％(83/102)，正常前列腺、BPH、HGPIN、HDPC與HIPC間GOLPH3的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。
　　 3.Real-time-PCR檢測GOLP

15、H3基因在4種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞株Du145、PC-3、LNcap和BPH中的表達(dá)。
　　 4種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞株中PC-3和Du145是雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株，其中Du145是高轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞株，PC-3是低轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞株，LNcap是雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株，BPH是良性前列腺增生細(xì)胞株。Real-Time PCR結(jié)果顯示，前列腺癌相關(guān)細(xì)胞株P(guān)C-3、Du145、LNcap和BPH中GOLPH3在轉(zhuǎn)錄水平都有不同

16、程度的表達(dá)，其中在Du145中表達(dá)最高，在PC-3、LNcap和BPH中表達(dá)較低。
　　 4.Western blot及免疫熒光染色檢測GOLPH3、AR蛋白在4種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞株中的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，前列腺癌相關(guān)細(xì)胞株P(guān)C-3、Du145、LNcap和BPH中GOLPH3在蛋白質(zhì)水平均有不同程度的表達(dá)，其中在Du145中表達(dá)最高，在PC-3、LNcap和BPH中表達(dá)較低;免疫熒光染色結(jié)果顯示，GOLPH3

17、在高轉(zhuǎn)移性的激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145中高表達(dá)，在低轉(zhuǎn)移性激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LNcap及良性前列腺增生細(xì)胞株BPH中低表達(dá);此外，AR在DU145、PC3及BPH細(xì)胞株中均呈低表達(dá)，在LNcap細(xì)胞株中AR高表達(dá)，符合細(xì)胞本身屬性。Western blot及免疫熒光染色檢測結(jié)果較一致。
　　 5.篩選GOLPH3的有效干擾片段商品化干擾片段siGOLPH3-554、siGOLP

18、H3-728和siGOLPH3-918轉(zhuǎn)染GOLPH3高表達(dá)的高轉(zhuǎn)移性的激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145，Real-time-PCR、Westem blot及RNA Structure軟件分析發(fā)現(xiàn)siGOLPH3-918片段干擾效率最高、最穩(wěn)定。
　　 6.構(gòu)建穩(wěn)定沉默內(nèi)源性GOLPH3的前列腺癌細(xì)胞株Du145/GFP+/GOLPH3-將siGOLPH3-918干擾片段連接于pGPU6/GFP/Neo siRNA Expr

19、essionVector，構(gòu)建重組體質(zhì)粒pGPU6/shGOLPH3-918，經(jīng)包裝細(xì)胞293FT包裝的慢病毒感染Du145前列腺癌細(xì)胞株，流式細(xì)胞儀熒光分選干擾后陽性細(xì)胞;Westernblot和細(xì)胞免疫組化檢測結(jié)果表明穩(wěn)定沉默內(nèi)源性GOLPH3的前列腺癌細(xì)胞株（命名為Du145/GFP+/GOLPH3-）成功建立。
　　 7.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡指數(shù)Du145/GFP+/GOLPH3-和對照細(xì)胞株Du145/GFP+

20、/mock細(xì)胞的S期細(xì)胞平均比例分別為28.583±0.743和57.978±0.902，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.546，P=0.000); Du145/GFP+/GOLPH3-和Du145/GFP+/mock細(xì)胞的凋亡指數(shù)分別為40.583±1.836和17.424±1.258，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.546， P=0.000)。MTT法檢測細(xì)胞體外增殖能力的影響，與Du145/GFP+/mock細(xì)胞相比，Du145/GFP+

21、/GOLPH3-細(xì)胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.282，P=0.000);平板克隆形成實驗Du145/GFP+/GOLPH3-細(xì)胞的活力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.359，P=0.017)。軟瓊脂集落形成實驗表明Du145/GFP+/GOLPH3-細(xì)胞形成的克隆體積更小、數(shù)目更少，差異具有顯著性(F=174.827，P=0.000)。說明沉默內(nèi)源性GOLPH3表達(dá)后能減弱前列腺癌細(xì)胞的錨定非依賴生長能力。

22、　　 三維細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示相對于Du145/GFP+/mock細(xì)胞，Du145/GFP+/GOLPH3-細(xì)胞團較致密，邊緣圓滑或局部皺縮;而對照細(xì)胞則表現(xiàn)為細(xì)胞團較大，邊緣松散并有偽足向周圍延伸。小室侵襲實驗表明，Du145/GFP+/mock細(xì)胞的運動能力是Du145/GFP+/GOLPH3-細(xì)胞的2倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.779，P=0.005）。Transwell小室檢測顯示Du145/GFP+/GOLPH3-細(xì)胞的

23、侵襲能力降低了2倍，差異具有顯著性（t=4.832，P=0.001）。平板劃痕愈合實驗結(jié)果顯示Du145/GFP+/GOLPH3-細(xì)胞的運動遷徙能力明顯比Du145/GFP+/mock對照細(xì)胞弱。
　　 8.Roche-NimbleGen的高密度全基因組表達(dá)譜芯片篩選出了165個與GOLPH3基因協(xié)同作用的基因和259個與GOLPH3基因拮抗作用的基因。其中GOLPH3基因沉默前后，DU-145細(xì)胞AR基因的表達(dá)沒有明顯的變化;

24、發(fā)現(xiàn)與GOLPH3基因相互作用的基因主要涉及到TGF信號通路、Hedgehog信號通路、MAPK信號通路、P53信號通路等，涉及到的細(xì)胞生物學(xué)功能主要有細(xì)胞運動、細(xì)胞粘著、細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、細(xì)胞周期調(diào)控等，其中與細(xì)胞周期調(diào)控(TGF-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2、TPK1)、細(xì)胞骨架重構(gòu)(MAP2、CAV1、FLNA)及與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)作用(PLAT、SPP1)的相關(guān)基因最為密切。通過熒光定量PCR方法，檢測TG

25、F-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2、TPK1、PLAT、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA基因在Du145/GFP+/GOLPH3-和DU145/EGFP+/mock細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示熒光定量PCR結(jié)果與芯片的結(jié)果是一致的，驗證芯片結(jié)果的可靠性。免疫組化結(jié)果顯示，與Du145/GFP+/mock相比較，Du145/GFP+/GOLPH3-細(xì)胞中TGF-β2、BMP7、E2F2、ARRB2、SPP1、MAP2

26、、CAV1及FLNA蛋白的表達(dá)降低，CREB5核PLAT蛋白的表達(dá)升高。139例HDPC中，TGF-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2、PLAT、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA蛋白中到強陽性表達(dá)率分別為15.11％、36.69％、58.27％、12.95％、40.29％、63.31％、42.45％、31.65％、27.34％和35.25％,102例HIPC中，TGF-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2

27、、PLAT、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA蛋白中到強陽性表達(dá)率分別為85.29％、55.88％、21.57％、62.75％、57.84％、40.20％、61.76％、75.49％、57.84％和56.86％。與在HDPC組織中的表達(dá)相比較，TGF-β2、BMP7、E2F2、ARRB2、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA蛋白在HIPC組織中到強度表達(dá)的陽性率表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別為0.000、0.005、0.

28、000、0.010、0.005、0.000、0.000和0.001，x2值分別為117.182、8.762、64.983、7.267、12.634、8.784、45.219、22.764和11.130;與在HDPC組織中的表達(dá)相比較，CREB5和PLAT蛋白在HIPC組織中到強度表達(dá)的陽性率表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別為0.000和0.001，x2值分別為32.386和12.634;免疫組化結(jié)果進一步驗證并支持芯片檢測結(jié)果。

29、
　　 結(jié)論：
　　 1.癌基因GOLPH3可能不是前列腺癌發(fā)生的早期分子事件，但癌基因GOLPH3與前列腺癌的演進高度相關(guān)。
　　 2.癌基因GOLPH3是前列腺癌細(xì)胞增殖、運動、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能的促進基因。
　　 3.癌基因GOLPH3可能通過TGF-β信號通路、Hedgehog信號通路，通過TGF-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2、PLAT、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA等功

30、能相關(guān)基因，調(diào)控前列腺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，重構(gòu)腫瘤周圍基質(zhì)微環(huán)境，從而促進激素依賴性前列腺癌的演進。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 (1) GOLPH3是新確定的癌基因，本項目在國際上首次發(fā)現(xiàn)并證明癌基因GOLPH3與前列腺癌的演進密切相關(guān)，是前列腺癌細(xì)胞增殖、運動和侵襲、轉(zhuǎn)移等功能促進基因。
　　 (2)雄激素是前列腺最主要的細(xì)胞增殖刺激物和細(xì)胞凋亡抑制物，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與AR依賴性

31、的信號通路密不可分。本研究結(jié)果表明GOLPH3可通過與AR無關(guān)的信號通路調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的生長，促進前列腺癌的演進。這一研究結(jié)果進一步豐富了前列腺癌與AR無關(guān)的旁路激活途經(jīng)的理論。
　　 (3) TGN的主要功能是參與蛋白質(zhì)的分類、包裝及運輸，保證蛋白質(zhì)的單向轉(zhuǎn)運，以往認(rèn)為定位于TGN的蛋白質(zhì)與癌癥發(fā)病沒有直接相關(guān)。本研究表明定位于TGN的蛋白質(zhì)GOLPH3具有促進前列腺癌演進的功能，為腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究提供新的視角，對揭示腫