線粒體DNA A-loop基因多態(tài)性與慢性腎臟病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究.pdf

1、目的:慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是危害人們健康的一種重要疾病，其臨床表現(xiàn)在各個(gè)階段不盡相同。進(jìn)入腎衰竭期以后，可表現(xiàn)為急性心力衰竭、高鉀血癥、胃腸道出血、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等，甚至出現(xiàn)生命危險(xiǎn)。該病在世界范圍內(nèi)發(fā)病率很高，最近的發(fā)病率研究調(diào)查顯示，在我國(guó)成年人中，慢性腎臟病的發(fā)生率很高，可達(dá)到10.8％。CKD的疾病發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)多種因素造成的、多個(gè)發(fā)展階段的綜合過(guò)程，其易患因素主要有年齡、糖尿病

2、、肥胖、代謝異常、高蛋白飲食、高血脂、高尿酸血癥等，但上述因素已不能完全解釋慢性腎臟病的高發(fā)病率。研究顯示，遺傳因素在CKD的疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。人體細(xì)胞內(nèi)的DNA易受氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞核內(nèi)的DNA因與組蛋白結(jié)合而不易受到氧化應(yīng)激的損傷，即使受到損傷，核內(nèi)存在的某些內(nèi)切酶也能有效的修復(fù)受損的DNA。而位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體DNA(mitochondrialDNA，MtDNA)由于其缺乏組蛋白的保護(hù)和有效的修復(fù)機(jī)制，因而

3、更容易發(fā)生損傷而導(dǎo)致突變。MtDNA的突變可發(fā)生在整個(gè)基因序列的各個(gè)位點(diǎn)處，但主要仍集中在包括D環(huán)(displacement loop，D-loop)在內(nèi)的非編碼區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，MtDNA D-loop區(qū)域的基因多態(tài)性與衰老以及多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如血液透析、冠狀動(dòng)脈疾病和癌癥等，但其與CKD的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)CKD患者和健康人MtDNA D-loop區(qū)的序列進(jìn)行檢測(cè)，探討MtDNA D-loop區(qū)的基因多態(tài)性與慢性腎臟病

4、發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　選取98例慢性腎臟病5期患者為病例組，所有患者均于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液凈化中心行維持性血液透析治療，其中包括53名男性，45名女性。入選標(biāo)準(zhǔn):①規(guī)律透析時(shí)間≥6個(gè)月;②透析頻次2-3次/周，每次透析4-4.5小時(shí);③近1月內(nèi)無(wú)創(chuàng)傷、急性感染及其他疾病活動(dòng);④近2周未使用抗氧化劑及降脂藥物的患者;⑤近3個(gè)月促紅素用法及用量不變;⑥自愿參加此實(shí)驗(yàn)研究。排除標(biāo)準(zhǔn):①肝功

5、能損傷較嚴(yán)重;②自身免疫性疾病存在活動(dòng);③嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)不良。選取于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的健康人159例為對(duì)照組，其中96名男性，女63名女性。入選標(biāo)準(zhǔn):所有入組人群均無(wú)腎臟病的病史或癥狀，無(wú)嚴(yán)重的心臟和肝臟疾病，無(wú)慢性腎臟病家族史。本實(shí)驗(yàn)已獲取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均自愿參加本研究，并簽署知情同意書。
　　2、實(shí)驗(yàn)方法
　　收集兩組人群的臨床資料，包括年齡、性別等。整夜禁食后采集兩組人群

6、的靜脈血液標(biāo)本，提取血中白細(xì)胞DNA。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增MtDNA D-loop區(qū)基因片段，于1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，確認(rèn)目的片段成功擴(kuò)增后送檢進(jìn)行測(cè)序。確定D-loop序列使用Snapshot基因測(cè)序法，由于MtDNA D-loop區(qū)基因序列較長(zhǎng)，固采用雙向重復(fù)測(cè)序的方法檢測(cè)同一樣本。使用DNAman軟件將線粒體文庫(kù)中的Revised Cambridge Refer

7、ence Sequence(rCRS)標(biāo)準(zhǔn)序列與所測(cè)D-loop序列進(jìn)行比對(duì)，確定MtDNA D-loop內(nèi)的多態(tài)性位點(diǎn)在病例組及對(duì)照組中出現(xiàn)的頻率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，MtDNA D-loop的多態(tài)性位點(diǎn)在兩組之間發(fā)生率的比較采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、病例組及對(duì)照組一般資料分析:兩

8、組間年齡、性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.166和0.363），兩組匹配。
　　2、MtDNA D-loop的基因多態(tài)性:兩組人群在MtDNA的D-loop區(qū)共發(fā)現(xiàn)103個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。其中有27個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在健康對(duì)照組和（或）病例組中出現(xiàn)的頻率大于5％。
　　3、MtDNA D-loop的基因多態(tài)性與CKD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系:與健康對(duì)照組相比，CKD患者73位點(diǎn)A突變?yōu)镚的頻率顯著升高(99％vs0％，P＜0.001)，

9、146位點(diǎn)T突變?yōu)镃的頻率顯著升高（16.3％vs0％，P＜0.001），150位點(diǎn)T突變?yōu)镃的頻率顯著升高（15.3％vs0％，P＜0.001），195位點(diǎn)T突變?yōu)镃的頻率顯著升高（7.1％vs0％，P=0.003），16266位點(diǎn)C突變?yōu)镃A的頻率顯著升高（6.1％vs0％，P=0.006），其余位點(diǎn)的突變率在兩組中無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　D-loop區(qū)73位點(diǎn)A突變?yōu)镚、146位點(diǎn)T突變?yōu)镃、15