線粒體D環(huán)區(qū)單核苷酸多態(tài)性與喉癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究.pdf

1、目的：喉癌（laryngeal carcinoma）是耳鼻咽喉-頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)的頭頸部腫瘤中大約占26％-30%[1]。近年來，隨著吸煙人群的增多和環(huán)境的逐漸惡化，喉癌的發(fā)病率日趨增加，對(duì)人類健康、生命的威脅日益增加。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，近幾年來已有學(xué)者提出線粒體DNA(mitochondria DNA,mtDNA)發(fā)生了變異是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有著不可或缺的緊密關(guān)系。線

2、粒體DNA是高等動(dòng)物中核外遺傳物質(zhì)的唯一存在場(chǎng)所，人類mtDNA是由16569個(gè)堿基組成的雙鏈閉合分子結(jié)構(gòu)，包含13種多肽編碼基因、2種核糖體RNA基因和22種轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因，在線粒體蛋白質(zhì)的合成過程中發(fā)揮重要作用。D-loop區(qū)是人類線粒體DNA的一段非編碼區(qū)域，位于mtDNA16024bp-576bp，在整個(gè)mtDNA序列中僅占6%，但其發(fā)生突變的幾率以及多態(tài)性卻較其他區(qū)域明顯增高，該區(qū)包含復(fù)制起始點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子等在mtDNA復(fù)制與

3、轉(zhuǎn)錄過程中的起主導(dǎo)作用的重要結(jié)構(gòu)，因此控制著mtDNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。本研究采用PCR和DNA測(cè)序的方法，對(duì)71例喉癌患者D-loop區(qū)的基因序列進(jìn)行檢測(cè)，分析探索D-loop區(qū)單核苷酸多態(tài)性與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為喉癌的早期診斷、治療與預(yù)后判斷提供新途徑。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象及標(biāo)本采集：選取2013年6月至2016年11月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科住院并行手術(shù)治療的71例喉癌患者作為本研究的對(duì)象，年齡

4、在39-73歲，均為男性。在獲取患者及家屬知情同意后，采集患者外周靜脈血3ml，將其放置在-4度冰箱內(nèi)冷藏保存，總計(jì)71例。此外，選取2012年至2013年間159例在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院體檢的正常人作為對(duì)照組，將體檢資料做詳細(xì)記錄，并在取得本人的知情同意后采集外周靜脈血標(biāo)本3ml。所有標(biāo)本的采集均由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理辦公室的委員會(huì)審核、同意并批準(zhǔn)。
　　2.實(shí)驗(yàn)及分析方法：使用DNA純化試劑盒對(duì)喉癌患者外周靜脈血以及

5、>　　正常對(duì)照組外周靜脈血標(biāo)本進(jìn)行線粒體DNA提取，需進(jìn)行定量鑒定，經(jīng)鑒定達(dá)標(biāo)后對(duì)標(biāo)本組織進(jìn)一步做聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）,使設(shè)計(jì)的mtDNA D-loop區(qū)的目的片段得以擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，同一標(biāo)本采用雙向重復(fù)測(cè)序。將結(jié)果與目前公認(rèn)的劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列作對(duì)比、分析（BLAST），總結(jié)mtDNA D-loop區(qū)突變與喉癌的關(guān)系。
　　3.統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.

6、0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)計(jì)數(shù)資料應(yīng)用2檢驗(yàn)計(jì)算P值，相對(duì)危險(xiǎn)度(OR值)及95%可信區(qū)間（CI），P＜0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.將喉癌組與對(duì)照組的臨床資料作比對(duì)發(fā)現(xiàn)：二者的性別與吸煙史有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。二者＜40歲與≥40歲的分布頻數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。
　　2.參照被公認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)的RA Cambridge序列，在71例喉癌組與159例對(duì)照組中的982bp的測(cè)序結(jié)果中共發(fā)現(xiàn)146個(gè)多態(tài)性

7、改變，多態(tài)率為14.9%，其中有2個(gè)位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)。喉癌組與對(duì)照組共發(fā)現(xiàn)25個(gè)高頻多態(tài)性位點(diǎn)。
　　3.用檢驗(yàn)對(duì)喉癌組與正常對(duì)照組mtDNA D-Loop區(qū)的單核苷酸多態(tài)性的分布頻率作比對(duì)，發(fā)現(xiàn)73G/A、309C/C insert、315 C/C insert、524C/del、556A/del、16288C/T、16291T/C、16311C/T、16319A/G這9個(gè)多態(tài)性變異位點(diǎn)與喉癌的發(fā)病相關(guān)。
　　在7

8、3位點(diǎn)，喉癌組有71例（100.0%）患者出現(xiàn)A堿基被G堿基替換，正常對(duì)照組出現(xiàn)了89例（56%），73G基因型在喉癌組的分布頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　在309位點(diǎn)，喉癌組有24例（33.8%）患者出現(xiàn)1個(gè)C堿基插入，而在正常對(duì)照組出現(xiàn)了116例（73.0%），309C insert基因型在喉癌組的分布頻率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　在315位點(diǎn)，有30例（42.

9、3%）喉癌患者出現(xiàn)C堿基插入，正常對(duì)照組中有149例（93.7%）出現(xiàn)C堿基插入現(xiàn)象，315C insert基因型在喉癌組的分布頻率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　在524位點(diǎn)，喉癌組出現(xiàn)C堿基缺失的有20例（28.2%），對(duì)照組有1例（0.6%），524C del基因型在喉癌組分布頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　在556位點(diǎn)，喉癌組有6例（8.5%）存在A堿基缺失，對(duì)照組

10、無A堿基缺失，556A del基因型在喉癌組的分布頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　在16288位點(diǎn)，喉癌組有4例（5.6%）存在T堿基被C堿基替換，對(duì)照組無改變，16288C基因型在喉癌組的分布頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）。
　　在16291位點(diǎn)，喉癌組有8例（11.3%）出現(xiàn)C堿基被T堿基替換，對(duì)照組出現(xiàn)2例（1.3%），16291T基因型在喉癌組的分布頻率明顯高于對(duì)照

11、組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020）。
　　在16311位點(diǎn)，喉癌組有14例（19.7%）出現(xiàn)T堿基被C堿基替換，對(duì)照組有15例（9.4%），16311 C基因型在喉癌組的分布頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.030）。
　　在16319A位點(diǎn)，喉癌組有4例（5.6%）出現(xiàn)G堿基被A堿基替換，對(duì)照組有25例（15.7%），16319A基因型在喉癌組的分布頻率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）。

12、>　　4.把與喉癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms， SNPs）分別同患者的臨床特征作比較，結(jié)果示16291T基因型在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（37.5%）中的分布頻率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（3.6%）高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其他與喉癌發(fā)病相關(guān)的SNPs和患者腫瘤直徑大小、分化程度、臨床分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及UICC TNM分期等臨床特征無關(guān)，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　

13、　結(jié)論：
　　1.喉癌多發(fā)生于常年吸煙的男性。
　　2.喉癌患者的D-Loop區(qū)具有高度多態(tài)性，高頻多態(tài)性位點(diǎn)在HV1、HV2、HV3這三個(gè)高變區(qū)均有分布，多態(tài)性的主要形式單堿基的置換，部分表現(xiàn)為插入與缺失。
　　3.在所有喉癌樣本中均發(fā)現(xiàn)了73G/A這一改變，穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步研究。
　　4.mtDNA D-Loop區(qū)的SNPs與喉癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性，73G、524del、556del、16288C、16291