尋找小分子物質(zhì)穩(wěn)定角蛋白結(jié)構(gòu)保護(hù)肝損傷的研究.pdf

1、慢性乙型肝炎、藥物性肝損害等其他多種因素可造成我國(guó)患者肝臟損傷，在肝損傷發(fā)生過(guò)程中患者個(gè)體之間差異較大，同種病因往往可導(dǎo)致完全不同的轉(zhuǎn)歸，因此其他潛在的造成這種個(gè)體差異的因素需要進(jìn)一步探究。角蛋白是三大細(xì)胞骨架蛋白中間絲蛋白的最大亞群，它在肝細(xì)胞中與肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān)，特別是研究發(fā)現(xiàn)角蛋白基因突變可導(dǎo)致宿主容易造成肝臟損傷，因此它是否作為一種潛在因素影響著患者不同的轉(zhuǎn)歸，有待進(jìn)一步研究。肝臟特異性角蛋白K18 R90C突變?cè)斐善浣Y(jié)

2、構(gòu)改變，使表達(dá)該類(lèi)角蛋白的肝細(xì)胞變得脆弱且使宿主容易發(fā)生肝臟損傷。尋找能夠逆轉(zhuǎn)突變角蛋白結(jié)構(gòu)的方法，從而恢復(fù)其結(jié)構(gòu)功能，是保護(hù)及治療肝臟損傷的一種新方法。
　　目的:本研究希望能夠找到逆轉(zhuǎn)突變角蛋白結(jié)構(gòu)的小分子物質(zhì)，穩(wěn)定其突變結(jié)構(gòu)，恢復(fù)角蛋白功能并為肝臟損傷提供保護(hù)，并研究相關(guān)小分子物質(zhì)的保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步闡述角蛋白結(jié)構(gòu)改變的原因。本研究為肝臟損傷提供了新的治療前景，同時(shí)也為以肝損傷為代表的“中間絲蛋白相關(guān)疾病”的治療提供了新的方向

3、。并且本研究為將來(lái)進(jìn)一步探究角蛋白是否與肝損傷個(gè)體差異有關(guān)，以及我國(guó)患者中角蛋白突變情況的研究提供了依據(jù)。
　　方法:本研究將通過(guò)以免疫熒光圖像為基礎(chǔ)的小分子藥物篩選方法，尋找能夠穩(wěn)定突變角蛋白結(jié)構(gòu)的小分子物質(zhì)，在突變細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中分別驗(yàn)證該小分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用，并將之作為預(yù)防性藥物檢測(cè)其在突變細(xì)胞和小鼠中的肝損傷保護(hù)作用，并進(jìn)一步通過(guò)免疫組化、免疫共沉淀以及重建實(shí)驗(yàn)探究小分子物質(zhì)的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:PKC412是一

4、種多蛋白激酶抑制劑，本研究發(fā)現(xiàn)它能夠改變K18 R90C突變結(jié)構(gòu)，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)它能使突變結(jié)構(gòu)恢復(fù)到正常的細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)。并且PKC412能夠?yàn)橥蛔兗?xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠提供保護(hù)，與未經(jīng)PKC412處理的細(xì)胞相比，其能夠減少細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)的表達(dá)，而與對(duì)照組小鼠相比，它能夠大大減少急性肝損傷的發(fā)生（PKC412處理小鼠平均血清ALT水平為266 U/L，而對(duì)照組小鼠平均ALT水平為6546 U/L，P＜0.05，且H&E染色表明PK

5、C412能夠減少小鼠急性肝損傷后肝臟出血）。本研究中還進(jìn)一步探究了PKC412產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PKC412是通過(guò)改變非肌肉型肌球蛋白重鏈(NMHC)IIA的磷酸化程度，從而調(diào)節(jié)其與角蛋白之間的結(jié)合程度來(lái)改變突變角蛋白結(jié)構(gòu)的，而研究中的重建實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，PKC412作為蛋白激酶抑制劑對(duì)NMHC-IIA的磷酸化改變而非對(duì)角蛋白的磷酸化改變是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。
　　結(jié)論:本文發(fā)現(xiàn)了多蛋白激酶抑制劑PKC412能夠逆轉(zhuǎn)突變角蛋白