hsa-miR-181a靶向TLR4調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì).pdf

1、目的：預(yù)測并擬定靶向作用于TLR4基因（TLR4 mRNA）的miRNA。觀察所擬定的miRNA對巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)的影響并探討其機(jī)制。
　　方法：通過生物信息學(xué)方法分析TLR4 mRNA3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）序列的二級結(jié)構(gòu)，同時利用在線預(yù)測工具預(yù)測并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)擬定可能靶向作用于TLR4基因的miRNA。通過ELISA測定巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。采用qPCR檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)擬定miRNA相對表

2、達(dá)量。使用RT-PCR測定巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平。通過western blot檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平。運(yùn)用熒光素酶報告基因技術(shù)分析擬定miRNA與TLR4 mRNA的靶向結(jié)合活性。
　　結(jié)果：⑴經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)擬定miR-181a作為靶向調(diào)控TLR4基因（TLR4 mRNA）的待驗(yàn)證miRNA。⑵在巨噬細(xì)胞被轉(zhuǎn)染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-18

3、1a mimic及對照的mimic，待0h、24h、48h、72h后,再分別予LPS刺激(時限為6h)，發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較相應(yīng)對照組及0h組顯著降低（均P＜0.05），尤其以5.0nM、48h組最為明顯；但當(dāng)巨噬細(xì)胞被轉(zhuǎn)染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-181a inhibitor及對照的inhibitor時，0h、24h、48h、72h后,再分別予LPS

4、刺激(時限為6h)，則發(fā)現(xiàn)miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較其對照組及0h組顯著升高（均P＜0.05），其中以5.0nM、48h組最為明顯。⑶在巨噬細(xì)胞分別被轉(zhuǎn)染5.0nM的miR-181a mimic（或?qū)φ盏膍imic）和miR-181a inhibitor（或?qū)φ盏膇nhibitor）48h，接著予LPS刺激6h后，發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組與其對照組相比，細(xì)胞內(nèi)

5、miR-181a相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組與其對照組相比，細(xì)胞內(nèi) miR-181a相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），同時發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic和miR-181a inhibitor處理組與各自對照組相比，細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA表達(dá)水平均無顯著差異（均P＞0.05），但miR-181a mimic處理組與其對照組相比，細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1

6、β、IL-6 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05），而miR-181a inhibitor處理組與其對照組相比，細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（均P＜0.05）。⑷通過熒光素酶報告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)：miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組T293細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）；miR-181a mimic+miR-181a inhibitor共轉(zhuǎn)染組T293細(xì)胞內(nèi)熒光