ANXA1在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥和藥物代謝酶CYP3A4表達(dá)調(diào)控中的作用.pdf

1、人細(xì)胞色素P4503A4( CYP3A4)參與50％以上臨床常用藥物的代謝和諸多典型致癌物的活化。其活性可以被許多物質(zhì)所誘導(dǎo)或抑制，這使得臨床上在藥物合用時會產(chǎn)生毒副作用增加、藥效降低甚至無效的結(jié)果。了解CYP3A4的調(diào)控將有助于指導(dǎo)臨床合理用藥，為減輕或避免藥物的毒副作用提供科學(xué)依據(jù)。本文采用建立阿霉素體外逐步誘導(dǎo)的方式建立了多藥耐藥細(xì)胞K562細(xì)胞模型，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段尋找與耐藥相關(guān)蛋白，研究其在腫瘤多藥耐藥中的貢獻(xiàn)，及與CYP3

2、A4之間的關(guān)聯(lián)，為理論及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 1.K562耐藥細(xì)胞的建立及雙向電泳法尋找分子靶點
　　 采用建立阿霉素體外逐步誘導(dǎo)的方式建立了多藥耐藥細(xì)胞K562細(xì)胞模型，K562細(xì)胞與阿霉素ADR共存的初期，細(xì)胞總處于增殖死亡的動態(tài)過程中，直至半年后，藥物一直維持在1mg/L濃度下，細(xì)胞的耐藥特性趨于穩(wěn)定。細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)好，增殖周期加快，與母細(xì)胞無異。誘導(dǎo)的K562/ADR細(xì)胞與母細(xì)胞相比，不但表現(xiàn)出對ADR高度耐受

3、，而且有多藥耐藥現(xiàn)象，尤其是長春新堿(VCR)和伊馬替尼(imatinib)，K562/ADR對ADR、VCR、imatinib的IC50分別提高了149、134和63.3倍，提示所建的耐藥細(xì)胞獲得了多藥耐藥特性。
　　 應(yīng)用高效液相色譜法測定耐藥株細(xì)胞內(nèi)阿霉素的積聚情況，結(jié)果顯示，在2hr時，K562細(xì)胞內(nèi)的阿霉素含量約為2.925μmo1/L·mg，比K562/ADR細(xì)胞內(nèi)阿霉素的含量1.522μmo1/L·mg高，p<0.

4、001，提示K562/ADR的P-gp外排泵可能發(fā)揮作用，將阿霉素排出細(xì)胞。1 week后，K562細(xì)胞幾乎全部死亡，而K562/ADR細(xì)胞內(nèi)的阿霉素積聚顯著升高但不影響其生理活性，提示K562/ADR細(xì)胞內(nèi)除了P-gp藥物外排泵還有其他耐藥機(jī)制在發(fā)揮著作用。此外，由于阿霉素主要通過CYP3A4代謝酶進(jìn)行代謝，故檢測了K562與K562/ADR細(xì)胞內(nèi)CYP3A4的表達(dá)變化，結(jié)果顯示CYP3A4表達(dá)變化不是引起K562細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生的原

5、因。
　　 為全面了解K562多藥耐藥產(chǎn)生的分子機(jī)制，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，用固相pH梯度等電聚焦雙向凝膠電泳，對所建立的以轉(zhuǎn)運蛋白高表達(dá)為主要耐藥機(jī)理的K562/ADR細(xì)胞進(jìn)行了研究，探討細(xì)胞耐藥后蛋白的變化，對只表達(dá)變化差異大的部分蛋白點進(jìn)行MALDI-TOF/TOF分析，搜索Swiss-Prot蛋白庫，鑒定了幾個蛋白的身份，這些蛋白質(zhì)表達(dá)情況的變化，是人白血病細(xì)胞K562從對藥物敏感到接觸到化療藥物ADR后轉(zhuǎn)運蛋白高表達(dá)，以

6、至產(chǎn)生多藥耐藥特性這一變化中細(xì)胞內(nèi)一系列分子事件的直接體現(xiàn)，是轉(zhuǎn)運蛋白及其表達(dá)調(diào)控的分子基礎(chǔ)。這些蛋白根據(jù)功能的不同總體可分為鈣結(jié)合蛋白、分子伴侶(chaperones)、代謝酶相關(guān)蛋白、蛋白合成或DNA合成相關(guān)蛋白等等。
　　 2.ANXA1蛋白的調(diào)節(jié)對K562細(xì)胞耐藥行為的影響
　　 為證實雙向電泳結(jié)果的可靠及真實，進(jìn)一步利用Western blot與細(xì)胞免疫化學(xué)方法驗證Spot1蛋白（ANXA1蛋白）在K562、K

7、562/ADR細(xì)胞中的表達(dá)差異。應(yīng)用pcDNA3.1(+)系統(tǒng)成功構(gòu)建ANXA1的表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染得到經(jīng)western blot鑒定的能穩(wěn)定表達(dá)ANXA1的K562/ADR細(xì)胞系。之后以該細(xì)胞系完成了對ADR及VCR的細(xì)胞毒性的影響的研究。實驗結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)的K562/ADR細(xì)胞對ADR及VCR的耐受程度顯著下降。同時，應(yīng)用人工合成miRNA技術(shù)手段，構(gòu)建ANXA1發(fā)夾結(jié)構(gòu)表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染得到經(jīng)western blot鑒定的

8、下調(diào)ANXA1表達(dá)的K562細(xì)胞系，對其ADR和VCR的IC50進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，ANXA1表達(dá)下調(diào)的K562細(xì)胞對ADR的耐受程度顯著提高，而對VCR的耐受程度幾乎和表達(dá)空載體的空白細(xì)胞一致。同時檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ANXA1的K562/ADR的DNAladder情況，結(jié)果顯示ANXA1表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況比對照細(xì)胞有所增加，提示ANXA1通過介導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。
　　 3.乳腺癌MCF-7細(xì)胞中ANXA1和C

9、YP3A4表達(dá)調(diào)控研究
　　 本部分實驗分析乳腺癌細(xì)胞MCF-7敏感細(xì)胞與耐藥細(xì)胞ANXA1的表達(dá)情況，與K562中ANXA1的表達(dá)情況相反，提示ANXA1在實體腫瘤細(xì)胞和血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮的作用不同。檢測MCF-7細(xì)胞中ANXA1、IL-6和CYP3A4mRNA水平和蛋白水平，結(jié)果提示在MCF-7細(xì)胞中ANXA、IL-6及CYP3A4可能存在信號通路調(diào)控通路。結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索報道結(jié)果，推測實體腫瘤MCF-7細(xì)胞中，ANX

10、A1表達(dá)通過IL-6調(diào)控下游CYP3A4行為，影響藥物代謝情況，這也可能是腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的原因之一。這些結(jié)果為將來進(jìn)一步利用本實驗中建立的細(xì)胞體系對ANXA1和CYP3A4在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥中的作用及表達(dá)調(diào)控研究、指導(dǎo)臨床用藥及初期診斷提供依據(jù)。
　　 4.胃癌ANXA1核定位與腹腔轉(zhuǎn)移的研究
　　 腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象是臨床腫瘤惡性行為之一。除了多藥耐藥現(xiàn)象外，腫瘤的分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等也是腫瘤進(jìn)程的重要指標(biāo)。本