TFPI及其片段的可溶性表達及對系膜增生性腎小球炎的治療作用.pdf

1、組織因子途徑抑制物(TFPI)是體內(nèi)外源性凝血途徑的天然抑制物。該蛋白由276個氨基酸組成,含有一個酸性的N末端,三個串聯(lián)的Kunitz型結(jié)構(gòu)域KD1、KD2、KD3和一個堿性的C末端。KD1和KD2與TFPI的抗凝作用緊密相關:KD2通過與Fxa結(jié)合形成Fxa/TFPI復合物,抑制Fxa的活性;KD1隨后與組織因子(TF)/FVIIa復合物中FVIIa結(jié)合,形成FXa/TFPI/FVIIa/TF四元復合物,抑制FVIIa/TF的整體活

2、性。KD3和C末端能夠使TFPI達到最佳抗凝效果,但具體機制尚不明確。TFPI與肝素、低密度脂蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)、血小板反應素-1(TSP-1)和脂多糖(LPS)等分子的結(jié)合都與KD3和C末端,后兩者還被認為與TFPI抑制血管平滑肌增殖、誘導血管內(nèi)皮細胞和系膜細胞凋亡有關。
　　 盡管重組TFPI尚未上市,但其在臨床中的應用價值一直是人們關注的熱點。在動脈粥樣硬化動物模型中,重組TFPI能顯著降低血小板及纖

3、維蛋白在斑塊破裂部位的沉積;TFPI基因局部轉(zhuǎn)染到經(jīng)球囊損傷的動脈粥樣硬化血管,可以顯著抑制內(nèi)膜的增生;在感染性膿毒血癥或血管彌漫性內(nèi)凝血(DIC)中,重組TFPI可以降低血漿中IL-6和TNF-a等炎癥因子的水平,動物的存活率或存活時間均顯著提高;重組TFPI治療敗血癥已經(jīng)完成Ⅲ期臨床試驗,顯示能夠降低患者28天內(nèi)的死亡率;IFPI防治深靜脈血栓、呼吸窘迫綜合征、缺血再灌注損傷、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中亦顯示出較好療效。
　　 長期以來

4、,TFPI的研制一直受限于蛋白表達水平低下。最初的實驗用TFPI來源于血漿提取和HepG2細胞培養(yǎng)上清,之后雖然分別在真核和原核系統(tǒng)獲得表達,但又各自存在缺陷。真核表達獲得的TFPI活性好,但表達量很低、代價高,所以不利于TFPI大量制備。原核細胞雖然能夠提高表達水平,但目的蛋白以包涵體形式存在,變復性后的純化過程相當繁瑣,也不適合于臨床研究。
　　 本研究首先希望找到一種既能保證TFPI活性又能實現(xiàn)高效表達的方式。首先,我們借

5、助于原核表達系統(tǒng)的融合標簽麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP),以期實現(xiàn)在原核中獲得有活性的TFPI可溶性表達。雖然我們獲得了TFPI的可溶性表達,遺憾的是表達的TFPI沒有活性。進而,我們采用畢赤酵母表達系統(tǒng),分別從基因二級結(jié)構(gòu)、密碼子偏好方面對基因進行了優(yōu)化,最后獲得了一定水平的具有活性的TFPI表達。
　　 本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)TFPI能夠誘導大鼠腎系膜細胞發(fā)生凋亡,且誘導凋亡的部位主要位于TFPI161位氨基酸以后。為了明確TFP

6、I誘導凋亡的具體結(jié)構(gòu)和抗凝功能,我們分別表達了TFPI161以后的區(qū)域:TFPI162-188為KD2和KD3之間的一段連接區(qū),TFPI187-241為KD3,TFPI240-276為C末端,TFPI162-241包括KD2和KD3之間的連接區(qū)及KD3,TFPI187-276包括KD3和C末端,TFPI162-276則包括所有上述結(jié)構(gòu)。將上述肽段分別融合于MBP的C末端,在大腸桿菌中獲得了表達;目的蛋白以可溶形式存在,經(jīng)親和層析和離子交

7、換層析純化獲得。通過活性分析,發(fā)現(xiàn)TFPIC末端具有抗凝活性,并且KD3能夠增強C末端的抗凝作用,但KD3本身不具有抗凝作用。經(jīng)凋亡實驗發(fā)現(xiàn),TFPI162-276能夠誘導系膜細胞發(fā)生凋亡,C末端在其中發(fā)揮主要作用。類似于抗凝功能,KD3不能夠單獨誘導系膜細胞凋亡,但能夠增強C末端誘導的凋亡。
　　 由于TFPIC末端能夠誘導系膜細胞凋亡,而系膜細胞是腎小球腎炎中關鍵細胞。該細胞的增生活化以及其分泌的細胞因子、細胞外基質(zhì)在增生性

8、腎小球腎炎發(fā)展中起了關鍵作用。抑制系膜細胞增殖或者誘導其凋亡,是治療增生性腎小球腎炎的關鍵手段。為了評價TFPI及其片段在體內(nèi)是否具有相同的促進腎小球系膜細胞凋亡作用,我們在大鼠抗Thy-1腎炎模型中,從動物整體觀察了TFPI、TFPI162-276以及單獨的C末端對系膜細胞的影響,以及對增生性腎小球腎炎的治療作用。實驗發(fā)現(xiàn),TFPI的C末端在體內(nèi)抑制了系膜細胞的增殖與活化,同時對腎功能起到了保護作用;TFPI162-276組保護腎功能