5-氟尿嘧啶-普朗尼克P85共聚物膠束抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　結(jié)腸癌(Colon Cancer)是目前威脅人類生命健康的最嚴(yán)重疾病之一，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中高居第二位，致死率則排在第三位。近年來在我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率均逐年升高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。在年齡段為40-50歲之間發(fā)病率最高，結(jié)腸癌具有極強(qiáng)的浸潤(rùn)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力，其最為常見的轉(zhuǎn)移部位是肝臟。當(dāng)前結(jié)腸癌最為流行的治療方法是進(jìn)行手術(shù)切除，但由于中晚期患者腫瘤發(fā)生廣泛的浸潤(rùn)，手術(shù)治療無法進(jìn)行大面積切除，且容易形成較大創(chuàng)面

2、，則需要通過化學(xué)治療的手段來緩解癥狀并延長(zhǎng)患者的存活時(shí)間。上世紀(jì)80年代，5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）開始用于結(jié)腸癌的臨床化學(xué)治療，直到1999年，5-Fu聯(lián)合甲酰四氫葉酸的方法成為結(jié)腸癌臨床化療的最重要方案。本世紀(jì)初，5-Fu聯(lián)合一系列其它化療藥物進(jìn)行結(jié)腸癌臨床治療逐漸代替了單藥療法，并沿用至今。然而，隨著化療時(shí)間延長(zhǎng)，所需化療藥物的劑量也不斷增加，另外，化療藥物本身具有極強(qiáng)的毒副作用，高濃度的化療藥物將對(duì)病

3、灶所在器官和周圍臟器造成嚴(yán)重的損傷。因此，有必要明確腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并在原有化療方案的基礎(chǔ)上研制對(duì)腫瘤靶向性較強(qiáng)，毒性作用較弱的藥物，以期在根源上遏制腫瘤的發(fā)展，使結(jié)腸癌患者生命得以延長(zhǎng)，同時(shí)顯著改善其生存質(zhì)量。
　　腫瘤干細(xì)胞（Cancer Stem Cells，CSCs）是腫瘤細(xì)胞的一部分，在腫瘤細(xì)胞中占比極小，但具有極強(qiáng)的增殖分化和運(yùn)動(dòng)能力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了普通腫瘤細(xì)胞，是造成腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的根本原因。腫瘤干細(xì)胞理論的

4、提出來源于胚胎干細(xì)胞，目前，許多研究者已在乳腺腫瘤、腦腫瘤等多種人體惡性腫瘤組織中分離并培養(yǎng)出腫瘤干細(xì)胞，經(jīng)研究并反復(fù)論證發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展的源泉。傳統(tǒng)的化學(xué)療法在初期可對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，一旦該抑制作用達(dá)到一定程度，觸及了腫瘤干細(xì)胞，則極有可能激活其干性，從而加速腫瘤的增殖分化，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生增殖、分化和轉(zhuǎn)移。雖然腫瘤干細(xì)胞數(shù)量極少，但其致瘤能力是普通腫瘤細(xì)胞的數(shù)百倍，這從根本上導(dǎo)致腫瘤難以被徹底清除。因此，基于

5、腫瘤干細(xì)胞理論，研究人員有必要明確腫瘤干細(xì)胞的特性，存活區(qū)域以及致瘤機(jī)制，以便從根源遏制腫瘤的發(fā)展。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是指在胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中，上皮細(xì)胞經(jīng)過特定的過程，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并具有間質(zhì)細(xì)胞的特性。尤其在腫瘤發(fā)展過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞所具備的最重要的特性之一，腫瘤干細(xì)胞極強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力即是通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化實(shí)

6、現(xiàn)的。該過程具有以下特點(diǎn):1、粘附分子E-cadherin功能缺失，細(xì)胞間的緊密連接逐漸消失，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng);2、細(xì)胞角蛋白發(fā)生形態(tài)學(xué)變化轉(zhuǎn)化為波形蛋白(Vimentin)，使細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征;3、在粘附分子表達(dá)受到抑制的同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子Twist表達(dá)發(fā)生上調(diào)，Snail因子，尤其是Snail1和Snail2因子表達(dá)明顯是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志。因此，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要過程，為了抑制該過程，就需

7、致力于在臨床一線化療藥物的基礎(chǔ)上，研發(fā)新的可靶向腫瘤干細(xì)胞，抑制腫瘤干細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的化療藥物。
　　普朗尼克（Pluronic）是由兩個(gè)聚氧化乙烯鏈和一個(gè)聚氧化丙烯鏈構(gòu)成的三嵌段聚合物納米材料(PEO-PPO-PEO)，在水中可自發(fā)形成環(huán)狀共聚物膠束，當(dāng)聚合物濃度高于臨界膠束濃度（Critical Micelle Concentration，CMC）時(shí)，該聚合物在水中可進(jìn)行首尾相接形成球形膠束結(jié)構(gòu)。其中，聚氧化丙烯鏈具有疏

8、水性特征，可作為膠束的內(nèi)核，與所包裹的藥物直接接觸;聚氧化乙烯鏈具有親水性特征，可與水相接觸，形成膠束的外殼。由普朗尼克自發(fā)聚合形成的膠束，不僅具有普通膠束所具備的一切特性，如增溶、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間和靶向性等，更重要的是，其在體內(nèi)可分解形成小分子，能夠顯著抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的合成，可在一定程度上降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性。在許多科學(xué)研究中，普朗尼克被譽(yù)為最有前途的臨床化療藥物載體之一，將被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤

9、藥物的載體研究。根據(jù)在常溫下普朗尼克的狀態(tài)差異，其大致可分為三種類型，分別為L(zhǎng):液體，P:糊狀，F(xiàn):固體，再根據(jù)普朗尼克聚合物長(zhǎng)度的不同，普朗尼克可被分為多種類型，如L61、F127、P407等。許多研究表明，無論是普朗尼克的形狀、安全性，還是其增強(qiáng)藥物敏感性方面，普朗尼克P85相對(duì)于L61等其它分支，都具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
　　鑒于以上理論及背景，本課題組在課題設(shè)計(jì)初期提出假設(shè):是否可使普朗尼克P85與結(jié)腸癌臨床一線化療藥物5-氟尿

10、嘧啶應(yīng)用物理、化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合，形成5-Fu/P85共聚物膠束，從而靶向腫瘤干細(xì)胞、抑制腫瘤干細(xì)胞的EMT進(jìn)程、控制腫瘤干細(xì)胞的比例，最終達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的。
　　目的：
　　本課題旨在明確結(jié)腸癌發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制，在原有化療藥物的基礎(chǔ)上采用物理、化學(xué)方法得到共聚物膠束，以期從根源上抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為指導(dǎo)臨床治療結(jié)腸癌發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移提供新思路、新方向。
　　方法：
　　1.采用薄膜水化法制備了三嵌

11、段共聚物普朗尼克P85與化療藥物5-氟尿嘧啶形成共聚物膠束，得到兩種不同濃度的共聚物膠束，分別用于體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的研究。
　　2.選取人的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)等方法，在體外探討5-Fu/P85共聚物膠束是否可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。
　　3.將結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116接種于Balb/c裸鼠脾臟，建立結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移小鼠模型，經(jīng)尾靜脈注射給藥后，觀察5-Fu/P8

12、5共聚物膠束是否可在體內(nèi)抑制小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生及生長(zhǎng)。
　　4.經(jīng)對(duì)小鼠肝功能指標(biāo)白蛋白和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)及對(duì)其存活時(shí)間的觀察，確定5-Fu/P85共聚物膠束是否可在一定程度上減輕化療藥物的毒副作用，延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，提高其生存質(zhì)量。
　　5.采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)5-Fu/P85共聚物膠束干擾后的HCT116細(xì)胞中，CD133+CXCR4+細(xì)胞比例是否降低，從而確定5-Fu/P85共聚物膠束是否具有靶向

13、腫瘤干細(xì)胞并殺傷腫瘤干細(xì)胞的作用。
　　6.在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，分別采用Transwell侵襲轉(zhuǎn)移、Realtime-PCR、免疫熒光染色和免疫組織化學(xué)染色等實(shí)驗(yàn)方法，通過對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因表達(dá)變化的檢測(cè)，揭示5-Fu/P85共聚物膠束抑制結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.在體外，5-Fu/P85共聚物膠束可顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的增殖和克隆形成能力;在體內(nèi)，5-Fu

14、/P85共聚物膠束可明顯抑制結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移瘤的大小并降低其惡性程度，降低化療藥物的毒副作用，延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間。
　　2.5-Fu/P85共聚物膠束可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞中CD133+CXCR4+細(xì)胞的比例。
　　3.5-Fu/P85共聚物膠束可在一定程度上抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞中CD133+CXCR4+細(xì)胞和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型肝臟腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的進(jìn)程。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)

15、薄膜水化法制備的5-氟尿嘧啶/普朗尼克P85共聚物膠束具有明顯的抗腫瘤作用，降低化療藥物5-氟尿嘧啶的給藥濃度后也可達(dá)到同樣的甚至更佳的抗腫瘤效果，明顯降低了化療藥物的毒副作用，減小肝臟及其它重要臟器受損傷風(fēng)險(xiǎn)和程度，同時(shí)可延長(zhǎng)生命并提高生存質(zhì)量。
　　經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，5-氟尿嘧啶/普朗尼克P85共聚物膠束抗腫瘤的作用機(jī)制是通過靶向結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞，抑制腫瘤干細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)這一進(jìn)程來實(shí)現(xiàn)的。因此，5-氟尿嘧啶/普朗尼克