FAK靶向RNAi對(duì)結(jié)腸癌5-氟尿嘧啶化療增敏作用及機(jī)制研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文FAK靶向RNAi對(duì)結(jié)腸癌5氟尿嘧啶化療增敏作用及機(jī)制研究姓名：陳玉英申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：梁后杰20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文苷酸技術(shù)。多細(xì)胞球(multicellularspheroids，MCSs)是很好的能模擬體內(nèi)實(shí)體瘤細(xì)胞特性的模型，與單層細(xì)胞相比，MCSs更接近體內(nèi)腫瘤的情況。因此本課題擬采用三維多細(xì)胞球培養(yǎng)模型，通過(guò)RNA干擾抑制FAK的表達(dá)，先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)多細(xì)胞

2、球藥物5FU敏感性的影響，進(jìn)而通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)裸鼠移植瘤藥物5FU敏感性的影響，并初步探討分子機(jī)制。研究方法1應(yīng)用免疫組化及Westemblotting檢測(cè)FAK在四種結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，并檢測(cè)結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中FAK、磷酸化FAKpY397、AKT、NF—KB、Caspase一3、Bcl—2等凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，分析與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，以及與FAK表達(dá)的相關(guān)性。2構(gòu)建FAKRNAi載體，對(duì)體外培養(yǎng)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞進(jìn)

3、行轉(zhuǎn)染，篩選相應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)克隆，干擾HT29細(xì)胞中FAK表達(dá)，并采用免疫組化、RTPCR、Real一timePCR、Westernblotting等方法鑒定FAK的被抑制情況。3將干擾前后的細(xì)胞進(jìn)行三維多細(xì)胞球體培養(yǎng)，采用血球記數(shù)法檢測(cè)抑制FAK表達(dá)對(duì)多細(xì)胞球的增殖的影響，通過(guò)MTT法和CCK一8試劑盒檢測(cè)抑制F：AK表達(dá)對(duì)多細(xì)胞球5Fu敏感性的影響，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制FAK表達(dá)對(duì)多細(xì)胞球的藥物5一FU誘導(dǎo)凋亡的影響。4采用West

4、emblotting檢測(cè)干擾前后多細(xì)胞球體中與FAK介導(dǎo)生存信號(hào)通路相關(guān)的凋亡蛋白磷酸化FAKpY397、AKT、NFKB、caspase3、Bcl一2等的水平，初步探討抑制FAK表達(dá)增加結(jié)腸癌多細(xì)胞球?qū)?Fu的敏感性的分子機(jī)制。5采用培養(yǎng)細(xì)胞皮下接種法建立裸鼠移植瘤模型，觀測(cè)FAK干擾對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。6應(yīng)用Westemblotting檢測(cè)不同組裸鼠移植瘤中FAK、磷酸化FAKpY397、AKT、NFKB、Caspase3、

5、Bcl一2等抗凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，初步探討抑制FAK表達(dá)對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制的分子機(jī)制。結(jié)果1四種結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo、HCTll6、HT_29、SW480內(nèi)都能檢測(cè)到FAK蛋白，其中HT29細(xì)胞中的FAK表達(dá)最高。結(jié)腸癌組織標(biāo)本中FAK、FAKpY397、AKT、NF—KB、Caspase一3、Bcl2的陽(yáng)性率分別為8243％、4595％、5270％、5946％、4865％、7027％，與正常結(jié)腸壁組織組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(