強制性運動療法促進腦缺血后大鼠的神經(jīng)發(fā)生與功能恢復的作用及其機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  中風仍然是全球范圍內致殘的主要原因之一。盡管有大量的康復手段的存在,但治療中風的有效的方法仍然是有限的。腦缺血后盡管大腦有高度的可塑性,但其局部微環(huán)境并不利于其自我修復,目前強制性運動療法(constraint-inducedmovement therapy, CIMT)廣泛地應用于康復領域,并被證實不僅能夠有效地促進肢體功能恢復,還能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)結構的改變。研究證實,CIMT能夠促進突觸的可塑性及軸突的再生從而改

2、善大鼠的運動功能。同時,CIMT能夠促進側腦室下區(qū)及海馬齒狀回的新生細胞的數(shù)量,但是CIMT的相關作用機制目前尚不清楚。研究還發(fā)現(xiàn)CIMT能夠提高間質細胞源性因子-1(Stromal cell-derivedFactor1,SDF-1)的水平,而且,SDF-1能夠提高環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosinemonophosphate,cAMP)的水平,從而激活cAMP信號轉導通路。cAMP信號轉導通路被認為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)可塑性

3、如神經(jīng)發(fā)生及軸突再生有關,我們的研究旨在腦缺血的動物模型中進行CIMT,探討其引起神經(jīng)功能恢復的形態(tài)學基礎及是否通過cAMP信號轉導通路發(fā)揮作用,這將會使我們從細胞分子水平更深入地了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復能力,為腦梗死的臨床康復提供理論基礎及治療靶點。研究顯示中風與年齡密切相關,年齡是影響中風康復的一個重要的因素。隨著年齡的增長,腦的生理學和神經(jīng)化學將發(fā)生很多改變,從而導致?lián)p傷后老年人腦的神經(jīng)生物學改變將不同于年輕人。那么,對于老年動

4、物的研究將更具有臨床轉化意義。然而關于CIMT在老年動物中所引起的神經(jīng)可塑性的研究目前仍然是空白。我們的研究進一步探討了對腦缺血后老年大鼠進行CIMT是否能夠促進神經(jīng)發(fā)生,減少細胞凋亡,進而影響神經(jīng)功能的恢復。
  方法:
  1、實驗動物的分組:成年大鼠的實驗采用雄性Wistar大鼠,體重200-250g,由遼寧本溪長生生物技術有限公司提供,隨機分為:假手術組,缺血組,缺血術后行強制性運動組(CIMT組),缺血術后行強制性

5、運動并給予蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)的拮抗劑H89組(H89組)。老年大鼠的實驗采用老年雄性SpragueDawley大鼠(18-20個月),體重600-800g,由遼寧本溪長生生物技術有限公司提供,隨機分為:假手術組,缺血組,缺血術后行強制性運動組(CIMT組)。
  2、大鼠腦缺血模型的制備:采用顱內注射內皮素-1(endothelin-1,ET-1)的方法制作腦缺血模型。根據(jù)大鼠腦解剖圖譜,用立體定位

6、的方法將ET-1注射到成年大鼠及老年大鼠大腦皮質的運動區(qū)及紋狀體區(qū)域以形成局部腦缺血。
  3、大鼠強制性運動模型的制備:腦缺血術后7天開始采用石膏繃帶固定大鼠健側(缺血病灶同側)上肢,使其強制使用患側上肢的方法制作強制性運動模型,為期3周。
  4、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)及生物素化葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)示蹤標記:在腦缺

7、血后2周,用立體定位的方法向成年大鼠顱內運動皮層內注射BDA進行皮質脊髓束的順行示蹤標記。在腦缺血術后5-6天開始,向成年大鼠及老年大鼠腹腔內注射BrdU100mg/kg標記新生細胞,每天2次,連續(xù)2天。
  5、微量滲透泵顱內給藥:在腦缺血術后7天,用立體定位的方法在成年大鼠頸部皮下埋置灌注PKA抑制劑H89的微量滲透泵,進行側腦室內持續(xù)給藥,連續(xù)14天。
  6、行為學測試:應用梯形平衡木行走實驗對大鼠肢體運動功能進行定

8、量評價。
  7、組織切片的制備:各組動物分別于腦缺血術后33天用多聚甲醛灌注固定,取成年大鼠腦及頸段脊髓,用冰凍切片機制作成年大鼠的腦切片(片厚30μm)及脊髓切片(片厚50μm),并制作老年大鼠的腦切片(片厚40μm)。
  8、梗死體積的測量:使用尼氏染色測量并比較成年大鼠缺血組、CIMT組及H89組之間腦梗死體積的差異與老年大鼠缺血組、CIMT組之間腦梗死體積的差異。
  9、免疫組化及免疫熒光染色:用免疫熒光

9、染色觀測成年大鼠梗死區(qū)域周邊NeuN/BrdU陽性細胞及脊髓內BDA標記的皮質脊髓束陽性纖維的延伸與分支情況。用免疫熒光染色觀測老年大鼠梗死區(qū)域周邊NeuN/BrdU、GFAP/BrdU及Iba-1/BrdU陽性細胞及側腦室下區(qū)的DCX/BrdU陽性細胞與海馬齒狀回的DCX陽性細胞。用TUNEL法檢測老年大鼠細胞凋亡的情況。
  10、放射免疫法:腦缺血術后33天,使用放射免疫法檢測成年大鼠梗死周邊皮層的cAMP的水平。
 

10、 11、Western blot:腦缺血術后33天,使用Western blot法檢測成年大鼠梗死周邊皮層的PKA C-α,pCREB,PSD-95(突觸標記物)及synaptophysin(突觸標記物)的水平。
  12、統(tǒng)計學處理:數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計分析軟件SPSS16.0 for windows進行。應用單因素方差分析及LSD-t檢驗來判斷差異的統(tǒng)計學意義。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差或均值±標準誤表示。P<0.05有統(tǒng)計學差異。<

11、br>  結果:
  1、梗死體積的測量。
  成年大鼠缺血組、CIMT組及H89組之間梗死體積沒有明顯差異(P>0.05)。老年大鼠缺血組與CIMT組之間梗死體積沒有明顯差異(P>0.05)。
  2、CIMT能夠提高成年大鼠梗死皮層cAMP的水平。
  成年大鼠腦缺血后cAMP的水平明顯升高(P<0.01),CIMT組的cAMP水平與缺血組相比有所降低(P<0.01)。
  3、CIMT能夠提高成年大鼠

12、梗死皮層PKA C-α的水平。
  成年大鼠腦缺血后梗死皮層核蛋白的PKA C-α的水平與假手術組比明顯降低(P<0.01),CIMT能夠顯著提高梗死皮層核蛋白的PKA C-α的水平(P<0.05);假手術組、缺血組、CIMT組漿蛋白的PKA C-α的水平?jīng)]有明顯差異(P>0.05)。
  4、CIMT能夠促進成年大鼠細胞核CREB磷酸化的水平。
  成年大鼠CREB磷酸化的水平在腦缺血后有所下降(P<0.01),CI

13、MT組較單純腦缺血組比,CREB磷酸化的水平有所增高(P<0.01); CIMT對CREB磷酸化的促進作用能夠被PKA抑制劑H89所拮抗(P<0.01)。
  5、CIMT能夠提高成年大鼠突觸標記物synaptophysin及PSD-95的水平。
  成年大鼠腦缺血后梗死周邊皮層的synaptophysin及PSD-95的水平明顯降低(P<0.01),CIMT能夠提高梗死周邊皮層的synaptophysin及PSD-95的水

14、平(P<0.05),H89能夠逆轉這種提高(P<0.05)。
  6、CIMT能夠促進成年大鼠腦缺血后BDA陽性纖維通過脊髓灰質聯(lián)合越過中線。
  成年大鼠缺血組BDA陽性纖維通過脊髓灰質聯(lián)合越過中線的軸突的總長度較假手術組相比明顯增多(P<0.01)。CIMT組BDA陽性纖維通過脊髓灰質聯(lián)合越過中線的軸突的長度較缺血組相比進一步增多(P<0.05)。H89能夠抑制這種CIMT促進腦缺血后皮質脊髓束再生的作用(P<0.01)

15、。
  7、CIMT能夠促進成年大鼠腦缺血后梗死區(qū)域周邊的BrdU/NeuN雙染陽性細胞數(shù)量增多。
  成年大鼠缺血組梗死周邊皮層BrdU/NeuN雙染陽性細胞數(shù)量較假手術組明顯增多(P<0.01),CIMT組BrdU/NeuN雙染陽性細胞數(shù)量較缺血組進一步增多(P<0.01),H89組與CIMT組相比則有所減少(P<0.01)。
  8、CIMT對腦缺血后成年大鼠運動神經(jīng)功能恢復的影響。
  缺血后成年大鼠平衡

16、木的錯誤百分率明顯高于假手術組(P<0.01),CIMT組大鼠平衡木的錯誤百分率明顯低于缺血組(P<0.05),而H89能夠拮抗CIMT的這種促進腦缺血后運動功能恢復的作用(前爪P<0.01;后爪P<0.05)。
  9、CIMT對腦缺血后老年大鼠海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖及樹突發(fā)育的影響。
  假手術組、缺血組及CIMT組三組之間海馬齒狀回的DCX陽性細胞的數(shù)量沒有明顯差異(P>0.05),各組之間海馬DCX陽性細胞樹突的

17、總長度也沒有明顯差異(P>0.05)。
  10、CIMT對腦缺血后老年大鼠側腦室下區(qū)新生神經(jīng)細胞的增殖、存活及分化的影響。
  缺血組側腦室下區(qū)的BrdU/DCX陽性細胞較假手術組明顯增多(P<0.01),CIMT組側腦室下區(qū)的BrdU/DCX陽性細胞數(shù)量與缺血組相比進一步增多(P<0.01)。缺血組梗死皮層周邊的BrdU/NeuN的陽性細胞數(shù)較假手術組明顯增多(P<0.01),CIMT進一步增加了梗死皮層周邊的BrdU/

18、NeuN的陽性細胞數(shù)(P<0.01)。CIMT組Iba-1和GFAP的表達與缺血組相比沒有顯著性差異(P>0.05)。
  11、CIMT對腦缺血后老年大鼠梗死周邊皮層的細胞凋亡的影響。
  缺血組的TUNEL陽性細胞數(shù)量較假手術組明顯增多(P<0.01), CIMT組的TUNEL陽性細胞數(shù)較缺血組明顯減少(P<0.01)。
  12、CIMT對腦缺血后老年大鼠運動功能恢復的影響。
  梯形平衡木行走實驗顯示ET

19、-1造成的局部腦缺血能夠使大鼠患側肢體產(chǎn)生明顯的運動功能損傷(P<0.01),CIMT組老年鼠平衡木的錯誤百分率與缺血組相比明顯降低(P<0.05)。
  結論:
  1、CIMT能夠促進成年大鼠腦缺血后梗死區(qū)域周邊的細胞存活及軸突再生。
  2、CIMT能夠促進成年大鼠腦缺血后運動功能的恢復。
  3、CIMT通過cAMP/PKA/CREB信號轉導通路發(fā)揮其促進腦缺血后成年大鼠神經(jīng)再生及功能恢復的作用。

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