基于Cofilin介導(dǎo)細(xì)胞凋亡探討電針促進(jìn)腦缺血大鼠認(rèn)知功能恢復(fù)的作用機(jī)制.pdf

1、缺血性卒中已成為世界各地長期神經(jīng)功能障礙和死亡的主要原因，約占所有卒中的80％。盡管已經(jīng)有幾十年的深入研究，但能夠針對性地治療缺血性卒中的措施仍然有限。腦缺血的主要致病機(jī)制包含谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性，鈣超載，炎癥反應(yīng)，血腦屏障破壞和氧化應(yīng)激等。這些病理因素或者環(huán)節(jié)相互影響，互為因果，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡與壞死，最終導(dǎo)致卒中后認(rèn)知功能障礙。廣泛認(rèn)為半暗帶中的細(xì)胞凋亡是可逆的過程。細(xì)胞凋亡的調(diào)控，在保護(hù)神經(jīng)元和改善認(rèn)知的過程中發(fā)揮著重要的作

2、用。因此，探討神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，尋找有效的治療方法減少腦損傷，已成為腦血管研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　絲切蛋白(Cofilin)是肌動蛋白結(jié)合蛋白，受LIMK介導(dǎo)的磷酸化而失活。過量谷氨酸，ATP耗竭或氧化應(yīng)激處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元，均發(fā)現(xiàn)Cofilin rod結(jié)構(gòu)的形成。產(chǎn)生這種棒狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元在突觸結(jié)構(gòu)、突觸轉(zhuǎn)運(yùn)和長時程突觸可塑性上都受到了一定程度損傷。Rod的形成主要是由于去磷酸化的Cofilin含量增加引起的，并且僅去磷

3、酸化的Cofilin牽涉線粒體轉(zhuǎn)位。Cofilin線粒體轉(zhuǎn)位在細(xì)胞凋亡程序的啟動中起到關(guān)鍵作用。此外，引起Rod形成的病理性刺激，均是缺血性卒中的重要病理機(jī)制。由此提示，Cofilin及其介導(dǎo)的Rod結(jié)構(gòu)與學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能密切相關(guān)，同時參與缺血性卒中細(xì)胞凋亡過程中。
　　目前，電針療法已成為腦卒中后康復(fù)治療的一種常見方法。督脈經(jīng)穴“百會”和“神庭”具有益氣升陽、填髓充腦、醒腦開竅之功效，常被用于治療神經(jīng)和精神疾病，如中風(fēng)，頭痛和

4、頭暈等。臨床和基礎(chǔ)研究均顯示，電針“百會”和“神庭”穴有利于保護(hù)卒中患者和動物模型的缺血性損傷。本課題組的臨床研究顯示，針刺“百會”、“神庭”穴在認(rèn)知康復(fù)訓(xùn)練基礎(chǔ)上可顯著提高腦卒中患者M(jìn)MSE、MoCA和FIM等認(rèn)知相關(guān)量表的評分。同時，我們以往實驗也發(fā)現(xiàn)電針“百會”、“神庭”穴能夠通過減少腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，顯著改善其認(rèn)知功能障礙。然而，電針治療缺血性卒中的分子機(jī)制尚不明確。
　　目的:(1)闡明Cofilin在缺血性

5、卒中后細(xì)胞凋亡中的潛在調(diào)控作用，為將Cofilin作為腦卒中新的治療靶點(diǎn)提供實驗依據(jù);(2)探討電針“百會”、“神庭”穴促進(jìn)腦缺血大鼠認(rèn)知功能恢復(fù)的可能分子機(jī)制，為中醫(yī)康復(fù)臨床實踐提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分 Cofilin在腦缺血大鼠皮質(zhì)梗死區(qū)細(xì)胞凋亡中的作用
　　(1)本研究利用ATP耗竭誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)元，建立體外缺血／缺氧損傷模型，明確Cofilin rod形成和細(xì)胞凋亡。(2)同時，以大腦中

6、動脈閉塞法制備缺血性卒中的實驗動物模型，通過TTC和NeuN染色來評估MCAO大鼠腦梗死的發(fā)展階段。(3)應(yīng)用免疫組化和TUNEL染色，觀察不同時間點(diǎn)（2h，8h，24h和7d）MCAO大鼠腦皮質(zhì)梗死區(qū)Cofilinrod生成和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。(4)為進(jìn)一步證實去磷酸化Cofilin在腦缺血中的作用，我們利用Limk1過表達(dá)抑制Cofilin的活化，觀察MCAO大鼠缺血半暗帶病毒感染區(qū)域Rod形成和Cofilin介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。

7、
　　第二部分電針“百會”、“神庭”穴調(diào)控Cofilin線粒體轉(zhuǎn)位減少皮質(zhì)缺血區(qū)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　(1)分別于腦缺血術(shù)后5min和6h，對MCAO大鼠進(jìn)行電針干預(yù)“百會”、“神庭”穴。(2)通過條件恐懼記憶以及神經(jīng)功能缺損得分和腦梗死體積，評價電針“百會”、“神庭”對腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。(3)采用Nissl染色和熒光染色以觀察腦缺血組織損傷、Cofilin rod形成、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元丟失情況。(4)并通過Wes

8、tern blot檢測缺血半暗帶Caspase-3的活性，及其胞漿和線粒體中Cofilin和p-cofilin的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分(1) ATP耗竭可誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)元Cofilin rod形成以及細(xì)胞凋亡。(2)TTC和NeuN染色顯示梗死體積從2h增加到24h，然后在MCAO后24h到7d穩(wěn)定。(3) Rod結(jié)構(gòu)在梗死核心區(qū)2h和半暗帶8h開始生成，24h達(dá)到峰值，然后在MCAO后7d減少。而逐步增多的

9、Rod結(jié)構(gòu)可能會逐漸誘導(dǎo)腦卒中后梗死皮層MAP2降解和細(xì)胞凋亡。(4)Limk1過表達(dá)抑制Cofilin的活化，可顯著降低MCAO大鼠缺血區(qū)半暗帶Rod的形成和MAP2降解，并減少Cofilin介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實了Cofilin在腦缺血中的作用。
　　第二部分(1)急性期電針“百會”、“神庭”穴治療MCAO大鼠可以顯著減小腦梗死體積，并改善腦損傷引起的神經(jīng)功能缺損癥狀和認(rèn)知功能障礙。(2) Western blot分析表明

10、，電針這兩個穴位還可以明顯抑制Cofilin的線粒體轉(zhuǎn)位和Caspase-3切割。(3)此外，免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果提示，電針“百會”、“神庭”穴治療不僅可以部分抑制Cofilin rod形成和MAP2降解，而且還顯著減少缺血性卒中誘導(dǎo)的腦組織損傷、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元丟失。
　　結(jié)論:(1)體內(nèi)和體外缺血可誘導(dǎo)Cofilin rod形成和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，而Limk1過表達(dá)抑制Cofilin過度激活，可顯著減少腦缺血后皮質(zhì)半暗帶Rod形成、