納米炭在乳腺癌腋窩淋巴結(jié)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、目的：
　　本研究以納米炭吸附表阿霉素對(duì)乳腺癌腋窩淋巴結(jié)示蹤及靶向化療進(jìn)行初步探索研究。首先，進(jìn)行納米炭與表阿霉素最合適的吸附配比及解吸附實(shí)驗(yàn)，其次，用乳腺癌兩種細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究納米炭-表阿霉素對(duì)兩種細(xì)胞的體外殺傷或增殖抑制作用，最后，按納入標(biāo)準(zhǔn)收集臨床病例及淋巴結(jié)組織標(biāo)本，初步研究納米炭及納米炭-表阿霉素混懸液對(duì)人乳腺癌腋窩淋巴結(jié)的示蹤和靶向化療作用，為臨床乳腺癌的治療提供新的思路。

2、>　　方法和結(jié)果：
　　1.納米炭對(duì)表阿霉素的吸附、解吸附實(shí)驗(yàn)研究
　　方法:利用高效液相色譜質(zhì)譜(LC-MS/MS)法和透析法測(cè)定納米炭對(duì)不同濃度表阿霉素的吸附和釋放作用。
　　結(jié)果:納米炭對(duì)表阿霉素具有良好的吸附性，1ml(50mg)納米炭與2ml濃度為2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml表阿霉素吸附率分別為94.66％、85.96％、80.12％、71.09％、69.03

3、％，隨著藥物濃度的增加，吸附率逐漸降低，達(dá)飽和后吸附率穩(wěn)定。1 ml(50mg)納米炭與2 ml濃度為5 mg/ml表阿霉素吸附后可以緩慢釋放表阿霉素，沒(méi)有突釋現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，48 h后趨于平衡，累積釋放率可達(dá)到65％左右。
　　2.納米炭-表阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用研究
　　方法:采用不同濃度的CNP-EPI處理MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞，CCK-8法測(cè)定不同濃度、不同時(shí)間對(duì)MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞

4、增殖的抑制作用;根據(jù)測(cè)定的IC50選取5μg/ml CNP-EPI，相應(yīng)濃度25μg/ml CNP及僅加培養(yǎng)基作用24 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:在1μg/ml～200μg/ml濃度范圍內(nèi)，CNP-EPI對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，48 h后仍有增加的趨勢(shì)，但逐漸趨于穩(wěn)定，且各時(shí)間段內(nèi)對(duì)細(xì)胞的抑制率與藥物濃度呈現(xiàn)劑

5、量依賴關(guān)系，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），而相應(yīng)各濃度CNP對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯;5μg/mlCNP-EPI作用細(xì)胞24 h后，顯微鏡下可以看到大量的細(xì)胞死亡，正常對(duì)照組和相應(yīng)濃度的CNP組細(xì)胞生長(zhǎng)未見(jiàn)明顯異常;流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CNP-EPI組作用兩種細(xì)胞24 h后，MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率為(14.37±6.25)％，死亡率可達(dá)(80.70±6.20)％;MCF-7細(xì)胞晚期凋亡率為(14.57±2.

6、41)％，死亡率可達(dá)(78.63±0.55)％，分別與相應(yīng)濃度CNP組及正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　3.納米炭混懸液在乳腺癌腋窩淋巴結(jié)示蹤效果的臨床研究
　　方法:將我科2012年5月至2014年6月收治的60例乳腺癌患者隨機(jī)分為A組、B組、C組。A組20例，于術(shù)前1天在乳暈周圍分4點(diǎn)皮下注射納米炭混懸液1ml;B組20例，于術(shù)前3天在乳暈周圍分4點(diǎn)皮下注射納米炭混懸液1ml;C組20例，于術(shù)前7

7、天在乳暈周圍分4點(diǎn)皮下注射納米炭混懸液1ml。手術(shù)方式采用開(kāi)放乳腺癌改良根治術(shù)或腔鏡下皮下腺體切除加腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)或乳腺癌局部擴(kuò)大切除加腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后分別記錄淋巴結(jié)清掃數(shù)目、淋巴結(jié)黑染、轉(zhuǎn)移情況。
　　結(jié)果:A組共清除淋巴結(jié)430枚，平均21.5±5.8枚;B組共清除淋巴結(jié)384枚，平均19.2±4.9枚;C組共清除淋巴結(jié)380枚，平均19.0±5.8枚;A組、B組、C組平均每例患者清除淋巴結(jié)數(shù)目比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

8、P＞0.05）。A組清除的430枚淋巴結(jié)中，黑染337枚，黑染率78.4％;B組清除的384枚淋巴結(jié)中，黑染248枚，黑染率64.6％;C組清除的380枚淋巴結(jié)中，黑染166枚，黑染率43.7％;三組間淋巴結(jié)黑染率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），可以認(rèn)為三組清除淋巴結(jié)總體黑染率之間有差別，A組淋巴結(jié)黑染率最高，C組淋巴結(jié)黑染率最低。A組共清除轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)40枚，其中黑染淋巴結(jié)28枚，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中黑染率70.0％(28/40);B組

9、共清除轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)54枚，其中黑染淋巴結(jié)33枚，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中黑染率為61.1％(33/54);C組共清除轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)39枚，其中黑染淋巴結(jié)22枚，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中黑染率56.4％(22/39)。三組比較，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的黑染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.納米炭-表阿霉素在乳腺癌陽(yáng)性淋巴結(jié)靶向化療中作用的研究
　　方法:將我科2014年2月至2014年12月收治的90例乳腺癌患者隨機(jī)分為對(duì)照組、示蹤組、載藥組。對(duì)照組30例

10、，未注射任何示蹤劑。示蹤組30例于術(shù)前24 h在乳暈周圍分4點(diǎn)皮下注射納米炭混懸液1 ml。載藥組30例于術(shù)前24 h在乳暈周圍分4點(diǎn)皮下注射納米炭-表阿霉素混懸液3 ml。手術(shù)方式采用開(kāi)放乳腺癌改良根治術(shù)或腔鏡下皮下腺體切除加腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)或乳腺癌局部擴(kuò)大切除加腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)，每個(gè)患者選取淋巴結(jié)均不超過(guò)2枚。將所取淋巴結(jié)平均分成兩份，一份送常規(guī)病理學(xué)檢查，另一份再平均分成兩小份，一份福爾馬林固定，石蠟包埋備做細(xì)胞凋亡和免疫組化檢查

11、，另一份置于-70℃冰箱冷藏保存，做表阿霉素濃度測(cè)定用。剩余淋巴結(jié)均送病理科檢查。常規(guī)HE染色篩選出有癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，載藥、示蹤組選取黑染及未黑染的癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，對(duì)照組選取癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)連續(xù)切片，做免疫組化Ki-67染色和TUNEL染色。
　　結(jié)果:載藥組黑染淋巴結(jié)中表阿霉素濃度為(2063.27±1236.39)ng/g，未黑染淋巴結(jié)中表阿霉素濃度為(108.77±96.39)ng/g;示蹤組黑染淋巴結(jié)中表阿霉素濃度為(143.7

12、2±89.36)ng/g，未黑染淋巴結(jié)中表阿霉素濃度為(110.68±56.00)ng/g;對(duì)照組淋巴結(jié)中表阿霉素濃度為(125.85±72.29)ng/g;載藥組黑染淋巴結(jié)中表阿霉素濃度明顯高于示蹤組黑染、未黑染和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);載藥組未黑染淋巴結(jié)中表阿霉素濃度同示蹤組黑染、未黑染和對(duì)照組比較，無(wú)明顯差異(P＞0.05）;示蹤組黑染淋巴結(jié)中表阿霉素濃與示蹤組未黑染和對(duì)照組之間兩兩比較，無(wú)顯著差異(P＞0.05

13、);載藥組黑染淋巴結(jié)中表阿霉素濃度明顯高于未黑染淋巴結(jié)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　載藥組黑染癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)為（2.34±0.54）％;示蹤組黑染癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)為（2.49±1.37）％;對(duì)照組癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)為（4.81±3.56）％;三組癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05）
　　載藥組黑染癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌細(xì)胞凋亡

14、指數(shù)為(14.19±6.96)％;示蹤組黑染癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（7.59±2.84）％;對(duì)照組癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(10.24±3.47)％;三組癌細(xì)胞凋亡指數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05)
　　結(jié)論：
　　1、納米炭對(duì)表阿霉素具有良好的吸附性能和緩釋作用，1ml納米炭與2ml表阿霉素濃度為5mg/ml～10mg/ml混合配比較合適;
　　2、CNP-EPI混懸液對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231、MCF