白細胞介素-21在乙型肝炎病毒感染中的作用研究.pdf

1、目的:
　　宿主的免疫功能在HBV的清除中起著至關重要的作用，急性HBV感染病毒能否徹底清除與宿主感染時年齡密切相關。近年的研究表明，在HBV感染的情況下，某些細胞因子、趨化因子可以招募活化的免疫細胞，如T細胞、B細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等，由外周血循環(huán)向肝臟聚集，在介導宿主先天性、適應性免疫反應及HBV的清除過程中起著非常重要的作用。由此可見，細胞因子的表達水平在抗病毒效果及疾病結(jié)局中起著關鍵的作用。
　　研究表明HBV

2、特異性CD8+T細胞可以通過細胞毒機制及非細胞毒機制抑制HBV的復制，由細胞因子介導的非細胞毒機制在下調(diào)HBV復制的過程中起著決定性的作用。在急性HBV感染早期活化的NK細胞、NKT細胞可以分泌大量的IFN-γ，在限制疾病進展中發(fā)揮著非常重要的作用。在HBV感染建立后，CD8+T細胞分泌的IFN-γ、TNF-α介導的非細胞毒機制在HBV清除中起著關鍵的作用。在肝內(nèi)，IFN-γ可以激活KCs表面IFN-γ受體的表達，在先天性及獲得性免疫反

3、應中起著非常重要的作用。TNF-α是HBV清除的關鍵細胞因子，肝內(nèi)TNF-α水平增高可以增強CD8+T對HBV的應答，導致對HBV感染的肝細胞清除病毒增強。TNF-α還可以通過刺激HBV特異性細胞毒T細胞、加速HBV mRNA的降解促進HBV病毒的清除。IL-10作為抑制性細胞因子在病毒感染的建立、持續(xù)及T細胞耗竭等過程中起著關鍵的作用。慢性乙肝患者體內(nèi)IL-10表達增加是HBV持續(xù)感染的主要因素。急性乙肝患者體內(nèi)IL-10分泌增加，激

4、活的NK細胞分泌IFN-γ的能力下降，HBV特異性CD4、CD8 T細胞應答減弱。封閉IL-10受體的策略可以恢復HBV特異性CD8+T細胞的應答，加速病毒的清除，有利于慢性HBV感染的控制。
　　IL-21可以促進CD4+T輔助細胞的功能，改善CD8+T細胞功能的耗竭狀態(tài)及免疫應答，并且可以增加TNF-α、IFN-γ的分泌，在慢性病毒感染的控制中起著非常重要的作用。慢性乙肝患者體內(nèi)IL-21水平降低可能與HBV持續(xù)感染關系密切。

5、IL-21在年齡相關的HBV感染慢性化中亦起著非常重要的作用。綜上所述，HBV感染過程中，IL-21可能通過調(diào)節(jié)免疫細胞分泌細胞因子及改善免疫應答在HBV感染的控制中起著非常重要的作用。
　　我們通過建立PBMCs與Huh7.93細胞共培養(yǎng)體系，來模擬HBV感染后肝臟微環(huán)境及機體的免疫功能狀態(tài)，為研究HBV感染的免疫清除機制提供可行的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。并利用這個共培養(yǎng)體系來研究體外培養(yǎng)條件下IL-21抑制HBV復制的機制，同時研究IL

6、-21與相關細胞因子之間的關系及對HBV復制的影響，為研究HBV感染免疫清除機制提供新的方法，為IL-21在控制HBV感染中的重要作用提供新的證據(jù)，為HBV感染的控制提供新的思路。
　　方法:
　　第一部分:PBMCs與Huh7.93細胞共培養(yǎng)體系的建立
　　本部分內(nèi)容分別采用健康志愿者的PBMCs和慢性乙肝患者的PBMCs與Huh7.93細胞系共培養(yǎng)，觀察細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-10的變化及

7、HBV復制的情況，探討細胞因子與HBV復制的關系。
　　第二部分:白細胞介素-21體外抑制乙型肝炎病毒的作用研究
　　我們觀察了不同濃度的IL-21、IL-10刺激Huh7.93細胞后Huh7.93細胞分泌HBV的情況，研究體外培養(yǎng)條件下IL-21、IL-10對HBV復制的直接影響。同時利用我們建立的Huh7.93細胞與cPBMCs共培養(yǎng)體系，觀察了IL-21刺激共培養(yǎng)的細胞后，HBV復制情況及細胞因子的變化情況，研究共培養(yǎng)

8、條件下IL-21對HBV復制的影響。
　　第三部分:白細胞介素-21與慢性乙肝患者疾病關系研究
　　鑒于細胞因子在慢性HBV感染中的重要作用，本部分內(nèi)容檢測慢性乙肝患者外周血中IL-21、IL-10、IFN-γ、 TNF-α細胞因子的水平，測定患者外周血中病毒成分HBV DNA定量、HBeAg定量、HBsAb定量，測定患者肝臟炎癥程度的指標ALT、AST。通過對上述指標的分析，及細胞因子與病毒復制指標、肝臟炎癥指標的關系來探

9、討細胞因子IFN-γ、 TNF-α、IL-21、IL-10在慢性HBV感染中的作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分:PBMCs與Huh7.93細胞共培養(yǎng)體系的建立
　　我們的結(jié)果顯示nPBMCs單獨培養(yǎng)與cPBMCs單獨培養(yǎng)時，cPBMCs分泌IFN-γ較nPBMCs分泌有所降低，cPBMCs分泌IL-I0較nPBMCs分泌有所增高，但是兩者分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-I0、IL-21比較均無統(tǒng)計學差異。Hu

10、h7.93細胞與nPBMCs及cPBMCs共培養(yǎng)后，細胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA定量、HBeAg定量、HBsAg定量均明顯增加。共培養(yǎng)細胞裂解液中HBV復制中間體較Huh7.93細胞單獨培養(yǎng)時明顯增多。共培養(yǎng)后細胞因子測定結(jié)果顯示，cPBMCs產(chǎn)生的IL-21、FN-γ較nPBMCs產(chǎn)生的明顯減少。相關分析表明，Huh7.93細胞與nPBMCs共培養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清液中FN-γ、TNF-α水平與IL-21水平呈正相關，而與cPBMCs共培

11、養(yǎng)時無相關性。
　　第二部分:白細胞介素-21體外抑制乙型肝炎病毒的作用研究
　　應用不同濃度IL-21刺激Huh7.93細胞后細胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA定量及細胞培養(yǎng)裂解液中HBV復制中間體均隨著IL-21的濃度增加逐漸降低。應用不同濃度的IL-10刺激Huh7.93細胞后結(jié)果提示低劑量的IL-10能明顯促進Hhh7.93細胞中HBV的復制。應用IL-21刺激Huh7.93細胞與cPBMCs共培養(yǎng)體系后，細胞培養(yǎng)上清液

12、中HBsAg、HBeAg、 HBV DNA定量明顯下降，細胞裂解液中HBV復制中間體亦明顯減少。應用IL-21刺激后，細胞培養(yǎng)上清液中IL-10的水平與未刺激組比較明顯下降。相關分析表明應用IL-21刺激共培養(yǎng)細胞后，細胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA水平與IL-21及IFN-γ呈正相關。
　　第三部分:白細胞介素-21與慢性乙肝患者疾病關系研究
　　我們的研究顯示，重度慢性乙肝患者血清中IL-10及ALT、AST水平較輕中度慢

13、性乙肝患者明顯增高。相關分析表明，HBV DNA定量水平與IL-21、IFN-γ水平呈負相關，HBeAg定量水平與IL-21水平亦呈負相關，TNF-α水平與ALT水平呈正相關。
　　結(jié)論:
　　(1)本研究在國內(nèi)外相關研究的基礎上，采用Huh7.93細胞系與PBMCs共培養(yǎng)來模擬HBV感染后人體肝臟微環(huán)境及免疫功能狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)PBMCs可以明顯促進Huh7.93細胞系中HBV的復制，在國內(nèi)外首次成功地建立了一個簡單可靠的細胞共

14、培養(yǎng)體系，為研究HBV感染免疫清除機制提供了新的方法，具有重要的實用價值。
　　(2)本研究利用這個共培養(yǎng)體系，我們研究了體外培養(yǎng)條件下IL-21抑制HBV復制的機制。明確了IL-21可以直接抑制體外培養(yǎng)條件下HBV的復制，同時發(fā)現(xiàn)IL-21可以通過下調(diào)IL-10的分泌起到抑制HBV復制的目的，為細胞因子間相互作用在調(diào)節(jié)HBV復制中的重要作用提供了直接的證據(jù)。另外我們還發(fā)現(xiàn)IL-10可以明顯促進體外培養(yǎng)條件下HBV的復制，為IL-