白細(xì)胞介素-21在乙型肝炎病毒感染中的作用研究.pdf

1、目的:
　　宿主的免疫功能在HBV的清除中起著至關(guān)重要的作用，急性HBV感染病毒能否徹底清除與宿主感染時(shí)年齡密切相關(guān)。近年的研究表明，在HBV感染的情況下，某些細(xì)胞因子、趨化因子可以招募活化的免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，由外周血循環(huán)向肝臟聚集，在介導(dǎo)宿主先天性、適應(yīng)性免疫反應(yīng)及HBV的清除過(guò)程中起著非常重要的作用。由此可見(jiàn)，細(xì)胞因子的表達(dá)水平在抗病毒效果及疾病結(jié)局中起著關(guān)鍵的作用。
　　研究表明HBV

2、特異性CD8+T細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞毒機(jī)制及非細(xì)胞毒機(jī)制抑制HBV的復(fù)制，由細(xì)胞因子介導(dǎo)的非細(xì)胞毒機(jī)制在下調(diào)HBV復(fù)制的過(guò)程中起著決定性的作用。在急性HBV感染早期活化的NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞可以分泌大量的IFN-γ，在限制疾病進(jìn)展中發(fā)揮著非常重要的作用。在HBV感染建立后，CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ、TNF-α介導(dǎo)的非細(xì)胞毒機(jī)制在HBV清除中起著關(guān)鍵的作用。在肝內(nèi)，IFN-γ可以激活KCs表面IFN-γ受體的表達(dá)，在先天性及獲得性免疫反

3、應(yīng)中起著非常重要的作用。TNF-α是HBV清除的關(guān)鍵細(xì)胞因子，肝內(nèi)TNF-α水平增高可以增強(qiáng)CD8+T對(duì)HBV的應(yīng)答，導(dǎo)致對(duì)HBV感染的肝細(xì)胞清除病毒增強(qiáng)。TNF-α還可以通過(guò)刺激HBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞、加速HBV mRNA的降解促進(jìn)HBV病毒的清除。IL-10作為抑制性細(xì)胞因子在病毒感染的建立、持續(xù)及T細(xì)胞耗竭等過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。慢性乙肝患者體內(nèi)IL-10表達(dá)增加是HBV持續(xù)感染的主要因素。急性乙肝患者體內(nèi)IL-10分泌增加，激

4、活的NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力下降，HBV特異性CD4、CD8 T細(xì)胞應(yīng)答減弱。封閉IL-10受體的策略可以恢復(fù)HBV特異性CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答，加速病毒的清除，有利于慢性HBV感染的控制。
　　IL-21可以促進(jìn)CD4+T輔助細(xì)胞的功能，改善CD8+T細(xì)胞功能的耗竭狀態(tài)及免疫應(yīng)答，并且可以增加TNF-α、IFN-γ的分泌，在慢性病毒感染的控制中起著非常重要的作用。慢性乙肝患者體內(nèi)IL-21水平降低可能與HBV持續(xù)感染關(guān)系密切。

5、IL-21在年齡相關(guān)的HBV感染慢性化中亦起著非常重要的作用。綜上所述，HBV感染過(guò)程中，IL-21可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及改善免疫應(yīng)答在HBV感染的控制中起著非常重要的作用。
　　我們通過(guò)建立PBMCs與Huh7.93細(xì)胞共培養(yǎng)體系，來(lái)模擬HBV感染后肝臟微環(huán)境及機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，為研究HBV感染的免疫清除機(jī)制提供可行的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。并利用這個(gè)共培養(yǎng)體系來(lái)研究體外培養(yǎng)條件下IL-21抑制HBV復(fù)制的機(jī)制，同時(shí)研究IL

6、-21與相關(guān)細(xì)胞因子之間的關(guān)系及對(duì)HBV復(fù)制的影響，為研究HBV感染免疫清除機(jī)制提供新的方法，為IL-21在控制HBV感染中的重要作用提供新的證據(jù)，為HBV感染的控制提供新的思路。
　　方法:
　　第一部分:PBMCs與Huh7.93細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立
　　本部分內(nèi)容分別采用健康志愿者的PBMCs和慢性乙肝患者的PBMCs與Huh7.93細(xì)胞系共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-10的變化及

7、HBV復(fù)制的情況，探討細(xì)胞因子與HBV復(fù)制的關(guān)系。
　　第二部分:白細(xì)胞介素-21體外抑制乙型肝炎病毒的作用研究
　　我們觀察了不同濃度的IL-21、IL-10刺激Huh7.93細(xì)胞后Huh7.93細(xì)胞分泌HBV的情況，研究體外培養(yǎng)條件下IL-21、IL-10對(duì)HBV復(fù)制的直接影響。同時(shí)利用我們建立的Huh7.93細(xì)胞與cPBMCs共培養(yǎng)體系，觀察了IL-21刺激共培養(yǎng)的細(xì)胞后，HBV復(fù)制情況及細(xì)胞因子的變化情況，研究共培養(yǎng)

8、條件下IL-21對(duì)HBV復(fù)制的影響。
　　第三部分:白細(xì)胞介素-21與慢性乙肝患者疾病關(guān)系研究
　　鑒于細(xì)胞因子在慢性HBV感染中的重要作用，本部分內(nèi)容檢測(cè)慢性乙肝患者外周血中IL-21、IL-10、IFN-γ、 TNF-α細(xì)胞因子的水平，測(cè)定患者外周血中病毒成分HBV DNA定量、HBeAg定量、HBsAb定量，測(cè)定患者肝臟炎癥程度的指標(biāo)ALT、AST。通過(guò)對(duì)上述指標(biāo)的分析，及細(xì)胞因子與病毒復(fù)制指標(biāo)、肝臟炎癥指標(biāo)的關(guān)系來(lái)探

9、討細(xì)胞因子IFN-γ、 TNF-α、IL-21、IL-10在慢性HBV感染中的作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分:PBMCs與Huh7.93細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立
　　我們的結(jié)果顯示nPBMCs單獨(dú)培養(yǎng)與cPBMCs單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，cPBMCs分泌IFN-γ較nPBMCs分泌有所降低，cPBMCs分泌IL-I0較nPBMCs分泌有所增高，但是兩者分泌細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-I0、IL-21比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Hu

10、h7.93細(xì)胞與nPBMCs及cPBMCs共培養(yǎng)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA定量、HBeAg定量、HBsAg定量均明顯增加。共培養(yǎng)細(xì)胞裂解液中HBV復(fù)制中間體較Huh7.93細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)明顯增多。共培養(yǎng)后細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果顯示，cPBMCs產(chǎn)生的IL-21、FN-γ較nPBMCs產(chǎn)生的明顯減少。相關(guān)分析表明，Huh7.93細(xì)胞與nPBMCs共培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FN-γ、TNF-α水平與IL-21水平呈正相關(guān)，而與cPBMCs共培

11、養(yǎng)時(shí)無(wú)相關(guān)性。
　　第二部分:白細(xì)胞介素-21體外抑制乙型肝炎病毒的作用研究
　　應(yīng)用不同濃度IL-21刺激Huh7.93細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA定量及細(xì)胞培養(yǎng)裂解液中HBV復(fù)制中間體均隨著IL-21的濃度增加逐漸降低。應(yīng)用不同濃度的IL-10刺激Huh7.93細(xì)胞后結(jié)果提示低劑量的IL-10能明顯促進(jìn)Hhh7.93細(xì)胞中HBV的復(fù)制。應(yīng)用IL-21刺激Huh7.93細(xì)胞與cPBMCs共培養(yǎng)體系后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液

12、中HBsAg、HBeAg、 HBV DNA定量明顯下降，細(xì)胞裂解液中HBV復(fù)制中間體亦明顯減少。應(yīng)用IL-21刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10的水平與未刺激組比較明顯下降。相關(guān)分析表明應(yīng)用IL-21刺激共培養(yǎng)細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA水平與IL-21及IFN-γ呈正相關(guān)。
　　第三部分:白細(xì)胞介素-21與慢性乙肝患者疾病關(guān)系研究
　　我們的研究顯示，重度慢性乙肝患者血清中IL-10及ALT、AST水平較輕中度慢

13、性乙肝患者明顯增高。相關(guān)分析表明，HBV DNA定量水平與IL-21、IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)，HBeAg定量水平與IL-21水平亦呈負(fù)相關(guān)，TNF-α水平與ALT水平呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　(1)本研究在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，采用Huh7.93細(xì)胞系與PBMCs共培養(yǎng)來(lái)模擬HBV感染后人體肝臟微環(huán)境及免疫功能狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)PBMCs可以明顯促進(jìn)Huh7.93細(xì)胞系中HBV的復(fù)制，在國(guó)內(nèi)外首次成功地建立了一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的細(xì)胞共

14、培養(yǎng)體系，為研究HBV感染免疫清除機(jī)制提供了新的方法，具有重要的實(shí)用價(jià)值。
　　(2)本研究利用這個(gè)共培養(yǎng)體系，我們研究了體外培養(yǎng)條件下IL-21抑制HBV復(fù)制的機(jī)制。明確了IL-21可以直接抑制體外培養(yǎng)條件下HBV的復(fù)制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-21可以通過(guò)下調(diào)IL-10的分泌起到抑制HBV復(fù)制的目的，為細(xì)胞因子間相互作用在調(diào)節(jié)HBV復(fù)制中的重要作用提供了直接的證據(jù)。另外我們還發(fā)現(xiàn)IL-10可以明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)條件下HBV的復(fù)制，為IL-