Th17型細胞在乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的作用及其分化機制.pdf

1、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝DNA病毒，具有嚴格的宿主和組織特異性，是全球感染性肝臟疾病的主要病因，據報道全球約每年100萬的患者死于HBV感染導致的各種疾病，如肝功能衰竭、肝硬化和肝癌，嚴重威脅人類的健康。HBV本身不引起肝細胞病變，肝臟的病理變化主要取決于機體免疫應答，尤其細胞免疫應答。HBV導致的免疫損傷十分復雜，加之缺乏有效的動物疾病模型，故目前乙型肝炎發(fā)生發(fā)展的免疫病理機制尚不十分清楚。

2、
　　Th17型細胞是一種輔助性CD4+T細胞，能夠分泌產生IL-17A（即IL-17）、IL-17F、IL-22、IL-6等細胞因子，孤獨核受體γt(Orphan nuclear receptor gamma t, RORγt)是調節(jié)Th17型細胞分化的關鍵轉錄因子。Th17型細胞可促進炎癥的發(fā)生發(fā)展，與許多免疫性疾病的致病機制密切相關。現發(fā)現Th17型細胞及其相關的細胞因子在HBV相關的肝臟疾病中明顯升高。但有關HBV抗原誘導

3、的Th17型細胞在肝臟免疫病理損傷的作用，以及影響其分化的機制尚不清楚，有待進一步研究。因此，本研究首先用HBV抗原定向誘導初始CD4+T細胞向Th17型細胞分化，并過繼轉移到能表達HBsAg和HBcAg的小鼠模型，以研究Th17型細胞在HBV感染中的致病作用；并進一步研究HBV抗原對Th17型細胞分化的影響及機制。
　　第一部分 HBV重組腺病毒的構建
　　目的：構建HBV重組腺病毒
　　方法：利用分子克隆技術將1.

4、3倍HBV全基因組(ayw亞型)真核表達質粒與穿梭質粒 pAdTrack連接，構建重組穿梭質粒 pAdTrack-HBV。測序驗證序列正確后，將重組穿梭質粒 pAdTrack-HBV線性化轉染到含有 pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183中構建HBV重組腺病毒質粒pAd-GFP/ HBV1.3。測序驗證后，將重組穿梭質粒pAd-GFP/HBV1.3線性化，用脂質體2000轉染到HEK293AD細胞進行包裝，并進一步擴增 HBV重組腺病

5、毒，用氯化銫梯度離心純化 HBV重組腺病毒，最后用HBV DNA FQ-PCR定量檢測HBV重組腺病毒濃度。
　　結果：pAdTrack-HBV質粒和pAd-GFP/HBV質粒分別經酶切，在1％瓊脂糖凝膠電泳，均可得到4.1Kb大小的酶切片段，大小與1.3倍HBV基因全長相符合。轉染pAd-GFP/HBV質粒的HEK293AD細胞在24小時后開始表達GFP熒光蛋白，1周后出現細胞病理效應。擴增后的HBV重組腺病毒的HBV DNA含

6、量為1.31×1010copies/ml，經氯化銫梯度離心純化后病毒指數為7.89×1012copies/ml。
　　結論：成功構建HBV重組腺病毒(Ad-HBV)。
　　第二部分 HBV感染小鼠模型的建立及小鼠對HBV的免疫應答反應
　　目的：建立急性HBV感染小鼠模型，研究HBV感染早期小鼠的免疫反應及其肝組織學改變。
　　方法：尾靜脈注射HBV重組腺病毒感染C57BL/6小鼠，在注射病毒后的第1、2、3、5

7、、7天收集小鼠血液、脾臟和肝臟。分離小鼠血清，用改良賴氏法檢測血清谷丙轉氨酶；時間分辨免疫熒光分析方法(IFMA)定量檢測血清 HBsAg、HBeAg、抗HBs、抗HBe和抗HBc；HBV FQ-PCR定量檢測血清HBV DNA。分離肝臟細胞，用HBsAg和HBcAg作用肝臟細胞后，ELISA檢測細胞因子INF-γ、IL-4和IL-17；Real-time PCR檢測肝臟組織HBV cccDNA；熒光顯微鏡觀察肝臟組織GFP蛋白表達；H

8、E染色切片檢測小鼠肝臟組織病理學檢查，免疫組化檢測肝臟HBsAg和HBcAg表達。
　　結果：Ad-HBV組與Ad組C57BL/6小鼠在注射初期（1d、2d）均出現血清谷丙轉氨酶輕度升高和肝臟組織輕度炎癥反應，兩組之間無統(tǒng)計學差異，第3天血清谷丙轉氨酶和肝臟組織學改變基本恢復正常。小鼠感染 Ad-HBV后的第1天血清檢測到 HBsAg和HBV DNA，肝臟組織也出現 HBsAg、HBcAg的表達和HBV cccDNA，第3天最明顯

9、。感染后第5天檢測到抗-HBs，第7天檢測到抗-HBc，而抗-HBe一直為陰性；HBsAg和HBcAg作用后不影響肝臟細胞的INF-γ、IL-4和IL-17細胞因子分泌水平。
　　結論：
　　尾靜脈注射 Ad-HBV能夠構建急性 HBV感染小鼠模型；Ad-HBV感染C57BL/6小鼠早期不產生特異性免疫反應與肝臟損傷作用。
　　第三部分 HBV抗原誘導的Th17型細胞對感染Ad-HBV小鼠的作用研究
　　目的：定

10、向誘導HBV抗原特異性Th17型細胞，并研究其對感染Ad-HBV小鼠的作用。
　　方法：
　　1．誘導HBV抗原特異性CD4+T細胞經C57BL/6小鼠鼻腔接種200μl含5×106 copies HBV重組腺病毒的病毒懸液，4周后加強一次，再經1周后取小鼠脾臟單個核細胞，將細胞分三組：HBV抗原+細胞因子組，HBV抗原組和PBS組。HBV抗原+細胞因子組，用細胞因子（TGF-β1ng/mL、IL-610ng/mL、IL-2

11、310ng/mL、抗IFN-γ5μg/mL、抗IL-45μg/mL）和HBV抗原（HBsAg20μg/ml和HBcAg20μg/ml）作用小鼠脾臟單個核細胞；HBV抗原組用HBsAg20μg/ml和HBcAg20μg/ml作用細胞；PBS組僅用PBS作用細胞。72小時后用CD4+T細胞磁珠分選脾臟單個核細胞的CD4+T細胞，把 CD4+T細胞與抗原提呈細胞（通過Mitomycin C處理健康小鼠脾臟單個核細胞獲得）按5：1混合，并加用上

12、述刺激因素繼續(xù)作用72小時。收集小部分細胞懸液用ConA刺激24小時后，ELISA檢測上清中IL-17、IL-22、INF-γ和IL-4的水平；流式細胞術（FCM）分析IL-17+CD4+T細胞、INF-γ+CD4+T細胞和IL-4+CD4+T細胞的百分比；Real-time PCR檢測細胞IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平。
　　2．構建小鼠肝臟急性損傷模型通過C57BL/6小鼠尾靜脈注射HBV重組腺病毒，感染病毒

13、3天后予以細胞過繼轉移。洗滌上述培養(yǎng)的HBV抗原特異性CD4+T細胞，PBS重懸細胞，將200μl含2×107個細胞的懸液尾靜脈注射給已感染HBV重組腺病毒3天的C57BL/6小鼠。24小時后處死小鼠，取小鼠血清用改良賴氏法檢測谷丙轉氨酶，取肝臟石蠟包埋，切片進行HE染色觀察肝臟病理學改變。
　　結果：
　　1．HBV抗原+細胞因子組 IL-17+CD4+T細胞的百分比，以及 IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平

14、顯著性高于HBV抗原組和PBS組，P＜0.01，且IL-17和IL-22分泌水平也顯著性高于其它兩組，P＜0.01。HBV抗原組的IL-17+CD4+T細胞百分比，以及IL-17和IL-22 mRNA水平和分泌顯著性高于PBS組，P＜0.01；HBV抗原組INF-γ+CD4+T細胞的百分比和INF-γ的分泌顯著性高于HBV抗原+細胞因子組和PBS組，P＜0.01。HBV抗原+細胞因子組、HBV抗原組和PBS組 IL-4+CD4+T細胞的

15、百分比和IL-4分泌無顯著性差異。
　　2．HBV抗原+細胞因子組和HBV抗原組的CD4+T細胞分別過繼轉移給感染Ad-HBV的C57BL/6小鼠，均能導致小鼠血清谷丙轉氨酶升高，以及肝臟組織明顯的炎癥反應，如肝細胞明顯腫脹，部分壞死，肝臟結構紊亂，大量的炎癥細胞浸潤。
　　結論：
　　1．用 HBV抗原（HBsAg和HBcAg）聯(lián)合細胞因子在體外成功定向誘導初始CD4+T細胞向Th17型細胞分化。
　　2．HB

16、V抗原特異性Th17型細胞可導致感染Ad-HBV小鼠的肝臟炎癥反應與組織損傷。
　　第四部分研究HBV抗原對Th17型細胞分化的影響及機制
　　目的：研究HBV抗原對小鼠Th17型細胞分化的影響及機制
　　方法：
　　1．分別用重組HBsAg、HBcAg、HBeAg免疫 C57BL/6小鼠，取三種抗原免疫組小鼠的脾臟單個核細胞，一部分細胞用相應HBV抗原（HBsAg20μg/ml，HBcAg2.5μg/ml，HB

17、eAg2.5μg/ml）作用24小時，流式細胞術檢測細胞的IL-17+CD4+T細胞百分含量。另一部分細胞用磁珠分選 CD4+T細胞，并與相應抗原和小鼠腹腔巨噬細胞共同培養(yǎng)72小時，real-time PCR檢測細胞的IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平，以及培養(yǎng)液IL-17和IL-22的含量。
　　2．檢測HBV三種抗原免疫組脾臟單個核細胞的TLR2、3、4、7和9 mRNA水平。分別用 HBV抗原作用相應免疫組小鼠

18、脾臟單個核細胞24小時，檢測細胞IL-6和IL-23 mRNA水平和分泌。不同劑量HBV抗原作用小鼠腹腔巨噬細胞24小時，檢測IL-6、IL-23 mRNA水平和分泌及其TLR7 mRNA水平和蛋白表達。siRNA沉默巨噬細胞 TLR7的表達，Western-Blot分析 siRNA抑制效率；以siRNA-TLR7小鼠巨噬細胞為 APC，分別加入三種不同的HBV抗原及相應的HBV抗原免疫的CD4+T細胞共同培養(yǎng)72小時，檢測CD4+T細

19、胞的IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平，以及 IL-17和IL-22的分泌水平；用 HBV抗原對siRNA-TLR7小鼠巨噬細胞作用后，檢測其IL-6和IL-23的分泌和mRNA水平。
　　結果：
　　1．HBsAg免疫組、HBcAg免疫組、HBeAg免疫組脾臟單個核細胞的IL-17+CD4+T細胞百分比顯著性高于佐劑組，P＜0.01，且CD4+T細胞的IL-17和IL-22 mRNA水平和分泌，以及RORγt

20、 mRNA水平均顯著性高于佐劑組，P＜0.01，但程度不一致。IL-17 mRNA水平和分泌依次是HBcAg組—HBeAg組—HBsAg組，三組間差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01；IL-22 mRNA水平和分泌依次是HBsAg免疫組—HBcAg免疫組—HBeAg免疫組，HBsAg免疫組顯著性高于HBcAg和HBeAg免疫組，P＜0.01，而在HBcAg和HBeAg免疫組之間無顯著性差異；RORγt mRNA水平依次是HBcAg免疫組—H

21、BeAg免疫組—HBsAg免疫組，HBcAg免疫組顯著性高于HBsAg和HBeAg免疫組，P＜0.01，而在HBsAg和HBeAg免疫組之間無顯著性差異。
　　2．與佐劑對照組比較， HBeAg免疫組小鼠脾臟單個核細胞的TLR2 mRNA水平顯著性升高，P＜0.01，HBcAg免疫組無明顯改變，而HBsAg免疫組則表達顯著性下降，P＜0.01；三種抗原免疫組TLR3 mRNA水平無明顯改變；HBcAg免疫組TLR4 mRNA水平顯

22、著性升高，P＜0.01，HBeAg免疫組無明顯改變，而在HBsAg免疫組其表達顯著性下降，P＜0.01；三種抗原免疫組TLR7 mRNA水平均顯著性升高（P＜0.01），以HBcAg免疫組升高最明顯；三種抗原免疫組TLR9 mRNA水平均顯著下降（P＜0.01）。HBsAg、HBcAg和HBeAg免疫組脾臟單個核細胞的IL-6 mRNA水平和分泌均高于佐劑組；而HBcAg和HBeAg免疫組IL-23 mRNA水平和分泌顯著性高于佐劑組，

23、P＜0.05。體外小鼠巨噬細胞在HBsAg、HBcAg和HBeAg作用下TLR7 mRNA水平和蛋白表達顯著性升高，P＜0.01。在HBcAg和HBeAg作用下，巨噬細胞IL-6和IL-23 mRNA水平和分泌顯著性升高，P＜0.01，呈濃度依賴關系，且以HBcAg作用最明顯；HBsAg作用巨噬細胞僅IL-6 mRNA水平和分泌顯著性升高，P＜0.01。siRNA-TLR7抑制靶基因效率近70%；siRNA-TLR7能顯著性抑制能顯著性

24、抑制三種 HBV抗原（HBsAg、HBcAg和HBeAg）免疫組小鼠CD4+T細胞IL-17、IL-22mRNA水平和分泌及RORγt mRNA水平的上調（P＜0.01）；能顯著性抑制三種HBV抗原上調小鼠巨噬細胞的IL-6 mRNA分泌和水平（P＜0.01），及顯著性抑制HBcAg和HBeAg上調小鼠巨噬細胞IL-23mRNA水平和分泌（P＜0.05）。
　　結論：
　　1．HBsAg、HBcAg和HBeAg能夠促進Th1