白細胞介素21在慢性HBV感染中免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的：
　　本研究以HBV感染自然史的橫向人群和接受抗病毒治療的CHB患者縱向隊列為對象，分析IL-21在HBV感染中的特點，通過研究IL-21在HBV感染中與Tfh細胞、B細胞、CD8+T細胞以及NK細胞之間的作用，并結(jié)合HBV表達質(zhì)粒攜帶小鼠模型，探討IL-21在病毒清除和HBV特異性抗體產(chǎn)生中的作用。
　　方法：
　　橫向研究對象共納入130例慢性HBV感染患者，包括免疫耐受期患者(IT)20例，HBeAg陽性C

2、HB患者75例，非活動性HBsAg攜帶者(IC)35例，55例健康志愿者作為對照組(HC)。縱向研究對象來源于替比夫定治療臨床研究隊列，共納入108例HBeAg陽性CHB患者，所有研究對象在治療基線、12周、24周和52周收集血清和肝素抗凝血。根據(jù)抗病毒治療52周后應(yīng)答情況分為完全應(yīng)答組(CR)和非完全應(yīng)答組(NCR)，CR組定義為達到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換伴隨HBV DNA低于檢測下限(＜2.5 log10 copies/mL)，NCR

3、組定義為未獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換或HBV DNA＞2.5 log10 copies/mL。根據(jù)抗病毒治療52周后HBV DNA水平分為病毒學(xué)應(yīng)答組(VR，HBV DNA＜2.5 log10 copies/mL)和非病毒學(xué)應(yīng)答組(NVR，HBV DNA＞2.5 log10 copies/mL)。
　　多組間計量資料采用單因素方差分析，不滿足方差分析條件時采用多個獨立樣本非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗，多個相關(guān)樣本采用F

4、riedman M檢驗，多重比較采用兩獨立樣本秩和檢驗;縱向研究中樣本重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用一般線性模型重復(fù)測量分析，保守Greenhouse-Geisser法校正得到的交互效應(yīng)的P值用于單變量分析，不同時間點組間多重比較采用LSD-t檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0和Graphpad Prism5.0進行處理及構(gòu)圖，所有統(tǒng)計分析基于雙側(cè)假設(shè)檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.I

5、L-21在HBV感染中的特點
　　1.1 慢性HBV感染患者血清IL-21濃度和外周血PBMC IL-21 mRNA表達水平均顯著高于HC(P＜0.001;P＜0.001)，免疫組化染色顯示CHB患者肝內(nèi)IL-21表達較HC明顯增強;
　　1.2 CHB患者IL-21主要來源于CD4+Th細胞，其中Th1、Th2、Th17以及Tfh細胞亞群均可分泌IL-21，以Th1和Tfh細胞亞群明顯，兩者表達水平均顯著高于Th2和Th1

6、7細胞亞群;
　　1.3 動態(tài)觀察48例接受替比夫定治療52周的HBeAg陽性CHB患者各時間點細胞因子變化，結(jié)果顯示血清TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17和IL-21水平隨抗病毒治療而下降，治療52周時水平較基線相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001; P=0.002; P＜0.001; P＜0.001; P＜0.001; P=0.007)，血清IFN-γ和IL-4水平在治療前后變化無統(tǒng)計學(xué)差異;CR組患者(n

7、=7)抗病毒治療12周血清IL-21水平顯著高于NCR組(n=41)(P=0.022)。
　　2.IL-21參與CXCR5+CD4+T細胞對B細胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究
　　2.1 采用PMA/ionomycin非特異刺激慢性HBV感染患者PBMC，結(jié)果顯示CXCR5+CD4+T細胞主要分泌IL-21，其表達量明顯高于其分泌的IL-4、IL-17和IFN-γ(P＜0.001)，而CXCR5-CD4+T細胞則以分泌IFN-γ為主;

8、
　　2.2 慢性HBV感染者外周血CXCR5+CD4+T細胞頻數(shù)顯著高于HC(P＜0.001)。結(jié)果顯示rHBcAg和rHBeAg刺激CXCR5+CD4+T細胞增殖呈劑量依賴性，高濃度rHBcAg可促進CXCR5+CD4+T細胞增殖，但過高濃度rHBeAg則抑制該細胞亞群增殖;
　　2.3 橫向研究顯示能夠發(fā)生自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的IC組，其外周血CXCR5+CD4+T細胞亞群的頻數(shù)顯著高于未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的

9、IT組(P＜0.001)和CHB組(P＜0.001)患者?？v向研究結(jié)果顯示，能夠發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的CR組(n=16)患者，其CXCR5+CD4+T細胞亞群的頻數(shù)在12周、24周和52周這三個時間點均顯著高于NCR組(n=26)患者(P＜0.05)，重復(fù)測量結(jié)果顯示CR組患者總體CXCR5+CD4+T細胞亞群頻數(shù)顯著高于NCR組患者(P=0.009)。CR組中87.5％患者(14/16)在抗病毒治療12周后其CXCR5+CD4+T

10、細胞頻數(shù)呈升高趨勢，而NCR組中只有50％的患者(13/26)呈現(xiàn)上升趨勢，顯著低于CR組(P=0.014);相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)12周CXCR5+CD4+T細胞頻數(shù)和基線之間的差值與血清HBeAg在12周和基線之間的差值成負相關(guān)（r=-0.358，P=0.020），即CXCR5+CD4+T細胞抗病毒治療12周后頻數(shù)增加幅度與HBeAg降低幅度正相關(guān);
　　2.4 HBV重疊多肽刺激發(fā)現(xiàn)IL-21+CXCR5+CD4+T細胞頻數(shù)在IC組患

11、者中最高(P＜0.001);縱向隊列中的結(jié)果顯示抗病毒治療24周和52周時，CR組(n=12)患者HBV特異性IL-21+CXCR5+CD4+T細胞頻數(shù)顯著高于NCR組(n=15)(P=0.005;P=0.002);
　　2.5 結(jié)果發(fā)現(xiàn)分泌HBeAb的B細胞頻數(shù)顯著降低(P=0.027)。在CXCR5-CD4+T細胞與B細胞共培養(yǎng)體系中加入rIL-21后，分泌HBeAb的B細胞頻數(shù)顯著增加(P=0.043);
　　2.6

12、慢性HBV感染者和HC初始CD4+T細胞在體外均能成功誘導(dǎo)為CXCR5+CD4+T細胞，CR組(n=6)患者和NCR(n=6)患者其初始CD4+T細胞分化為CXCR5+CD4+T細胞能力無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.59);
　　2.7 慢性HBV感染后行脾切除術(shù)的肝硬化患者(n=10)外周血CXCR5+CD4+T細胞與脾臟ICOS+PD-1+CXCR5+CD4+T細胞的頻數(shù)呈正相關(guān)（r=0.723，P=0.018）。
　　3.IL

13、-21對CD8+T細胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究
　　3.1 慢性HBV感染者外周血CD8+T細胞IL-21R mRNA水平顯著高于HC組(P＜0.001)。病毒學(xué)應(yīng)答組(VR) CHB患者12周CD8+T細胞IL-21R mRNA水平較基線顯著降低(P=0.017)，NVR組12周CD8+T細胞IL-21R mRNA水平呈增加趨勢，與基線相比無統(tǒng)計學(xué)差異，但顯著高于VR組患者(P=0.007);
　　3.2 rIL-21體外刺激可

14、促進CHB患者CD8+T細胞CD69表達(P=0.035)，顆粒酶B(P＜0.001)和穿孔素的分泌(P=0.004)。在HBV重疊肽的作用下，rIL-21可增加HBV Core特異性CD8+T細胞頻數(shù)(P=0.012)和HBV特異性顆粒酶B的分泌(P=0.047)，但未能明顯增強穿孔素和IFN-γ表達。
　　4.IL-21對NK細胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究
　　4.1 CHB患者外周血NK細胞抑制性受體NKG2A和激活性受體NK

15、p46表達頻數(shù)顯著高于HC(P＜0.001;P=0.001)，而激活性受體CD16和NKG2D表達則顯著降低(P=0.001; P=0.042)。與HC相比，CHB患者外周血NK細胞介導(dǎo)ADCC的能力和分泌IFN-γ水平顯著降低(P＜0.001;P=0.017);
　　4.2 體外實驗發(fā)現(xiàn)rIL-21可顯著上調(diào)CHB患者NK細胞CD16、NKp46和NKG2D表達(P＜0.001)。單用rIL-21刺激可提高NK細胞分泌IFN-γ

16、，并促進rIL-12、rIL-15和rIL-18對NK細胞IFN-γ分泌的作用。rIL-21可顯著提高NK細胞ADCC效能和增殖能力(P=0.008; P=0.022)。
　　結(jié)論：
　　1.CHB患者血清和肝內(nèi)IL-21水平均高于HC組，CHB患者替比夫定治療12周血清IL-21水平能預(yù)測治療52周HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，提示IL-21可作為CHB患者抗病毒療效評價的免疫學(xué)指標;
　　2.CXCR5+CD4+T細胞的頻

17、數(shù)在發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的慢性HBV感染者更高，其可通過分泌IL-21促進B細胞產(chǎn)生HBeAb，提示通過擴增CXCR5+CD4+T細胞或促進IL-21表達可能有助于CHB患者的優(yōu)化治療;
　　3.rIL-21體外刺激可促進CHB患者CD8+T細胞活化，增強HBV特異性和非特異性CD8+T細胞的細胞毒活性，提示其在促進肝臟炎癥和損傷中發(fā)揮作用;
　　4.慢性HBV感染可導(dǎo)致NK細胞功能受損，rIL-21可促進慢性HBV感染