炎癥反應(yīng)在未成熟腦損傷發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、研究背景:
　　腦性癱瘓（簡稱腦癱）是指主要由圍生期因素導致新生兒腦損傷所遺留的運動損傷綜合征，是導致兒童傷殘的首要原因，目前已成為世界性的公共衛(wèi)生難題。研究顯示，宮內(nèi)感染和缺氧缺血性腦損傷是腦癱發(fā)生的兩個主要致病因素，兩者主要通過炎癥反應(yīng)機制介導腦損傷，導致腦癱的發(fā)生。大量細胞因子在炎癥反應(yīng)過程中被激活并相互作用、相互影響，共同參與調(diào)節(jié)機體的病理生理過程，是不同致病因素導致腦損傷的共同路徑。此外，炎癥反應(yīng)和早期的免疫反應(yīng)可部分重

2、疊，兩者均可通過誘導細胞因子釋放增加參與機體的炎癥進程，由于早產(chǎn)兒免疫功能不成熟，常常存在神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）免疫功能的失調(diào)，包括Th細胞亞群失衡，以及Th相關(guān)細胞因子的分泌異常，導致CNS的炎性病變而引起腦損傷。因此，深入探討炎癥反應(yīng)及其炎性細胞因子的變化在未成熟腦損傷機制的研究中具有重要意義。
　　胎兒或新生兒期的炎癥反應(yīng)可以持續(xù)至兒童期，提示腦癱的發(fā)生可能與外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎性細胞因子的持續(xù)作用有關(guān)，而細胞因子水平的變化受

3、基因的調(diào)控，因此，研究炎性細胞因子基因多態(tài)性有助于揭示其與腦癱易感性之間的關(guān)系。白細胞介素（Interleukin,IL）-6、IL-8、IL-10和IL-17A是具有廣泛生物學活性的多肽類細胞因子，在機體炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，與新生兒腦損傷及腦癱關(guān)系密切，但是關(guān)于IL-6、IL-8、IL-10和IL-17A單核苷酸多態(tài)性（SNPs）在小兒腦癱中的聯(lián)合研究，目前尚未見報道。
　　表皮葡萄球菌（Staphylococcus e

4、pidermidis,SE）是我們生活環(huán)境中廣泛存在的一種細菌，在NICU有高感染率，與早產(chǎn)兒感染關(guān)系密切，是導致早產(chǎn)兒菌血癥、晚發(fā)型敗血癥及血管內(nèi)導管相關(guān)性感染的最常見致病菌。流行病學研究顯示早產(chǎn)兒SE感染與腦損傷之間存在相關(guān)性，可能與早產(chǎn)兒大腦發(fā)育不成熟及免疫力低下有關(guān)。研究表明SE可部分通過Toll樣受體-2（TLR2）介導炎癥反應(yīng)而引起早產(chǎn)兒腦損傷，但確切的反應(yīng)機制目前仍不清楚。
　　新生兒雖然免疫功能不成熟，但并非完全免

5、疫缺陷，仍有一定的免疫應(yīng)答能力。在未成熟腦缺氧缺血性腦損傷模型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)T細胞（CD4+和CD8+）和B細胞出現(xiàn)在損傷部位，以及Th細胞亞群相關(guān)的細胞因子高表達，提示細胞免疫/炎癥反應(yīng)參與了缺氧缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程。
　　本研究將以早產(chǎn)腦損傷及其嚴重后遺癥腦癱為研究對象，通過臨床研究以及動物模型的實驗研究，從基因調(diào)控、感染及缺氧缺血引起的免疫失調(diào)等方面探索炎癥反應(yīng)在未成熟腦損傷發(fā)生發(fā)展中的作用，為腦癱的預(yù)防、診斷和治療提供理

6、論基礎(chǔ)。
　　第一部分炎性細胞因子基因多態(tài)性與腦癱的關(guān)聯(lián)性研究
　　目的:
　　采用大樣本病例-對照研究，通過分析腦癱患兒IL-6、IL-8、IL-10和IL-17A基因多態(tài)性及其相應(yīng)蛋白表達水平，在中國漢族人群中探討炎性細胞因子和腦癱易感性之間的關(guān)系。
　　方法
　　本研究選擇713例腦癱患兒作為腦癱組，同期隨機選取753例體檢兒童為正常對照組，兩組年齡比較無統(tǒng)計學差異。分別選擇
　　1.IL-6基

7、因的5個SNP位點（rs1800796，rs2069837，rs2066992，rs2069840和rs10242595）；
　　2.IL-8基因的4個SNP位點（rs4073、rs2227307、rs2227306和rs2227543）；
　　3.IL-10基因的5個SNP位點（rs3024490、rs1800896、rs1800872、rs3021094和rs1518110）；
　　4.IL-17A基因的5個SNP

8、位點（rs3819025、rs3748067、rs2275913、rs8193036和rs3819024），共19個SNP位點，使用Massarray分型技術(shù)對兩組的研究對象進行基因分型。
　　從上述兩組中選取85例腦癱患兒及75例正常對照兒童，使用液相芯片技術(shù)Luminex檢測外周血IL-6、IL-8、IL-10和IL-17水平。
　　使用SHEsis在線軟件進行基因數(shù)據(jù)分析，每個SNP的多重檢驗均使用SNPSpD在線系統(tǒng)

9、進行校正。使用Student’s t檢驗、Mann-Whitney’s檢驗及單因素方差分析進行蛋白數(shù)據(jù)分析，以P<0.05作為差異有無統(tǒng)計學意義的檢驗水準。
　　結(jié)果:
　　1. IL-6、IL-8和IL-10所有SNP位點的等位基因及基因型頻率分布在腦癱組和正常對照組中均沒有顯著性差異（P>0.05）；而IL-17A的rs3819024位點的等位基因型及基因型頻率分布存在顯著性差異（P=0.009，SNPSpD校正后P=0

10、.027；P=0.005，SNPSpD校正后P=0.015）。
　　2.亞組分析顯示：
　?。?）IL-6 rs2069837位點的等位基因頻率在男性腦癱組與男性對照組之間存在顯著性差異（P=0.009，SNPSpD校正后P=0.027）；
　?。?）IL-6 rs2069837位點的等位基因頻率在男性痙攣型腦癱組與男性對照組中的分布存在顯著性差異（P=0.007，SNPSpD校正后P=0.021）；
　　（3）

11、IL-6 rs1800796和rs2066992位點的基因型頻率在男性腦癱伴PVL組與男性對照組中的分布存在差異（P=0.014，SNPSpD校正后P=0.042；P=0.013，SNPSpD校正后P=0.039）；
　?。?）IL-10 rs3024490位點的等位基因和基因型頻率在痙攣型四肢癱組與對照組之間存在顯著性差異（P=0.004，SNPSpD校正后P=0.012；P=0.005，SNPSpD校正后P=0.015）；

12、r>　?。?）IL-17A rs2275913的等位基因和基因型頻率在痙攣型四肢癱組與對照組之間存在顯著性差異（P=0.002，SNPSpD校正后P=0.006；P=0.006，SNPSpD校正后P=0.018），而rs3819024位點與痙攣型四肢癱存在強相關(guān)性（P=0.000, P=0.000）。
　　3.外周血IL-6、IL-10和IL-17水平在腦癱組中高于對照組（P均＜0.05），且基因分型可影響IL-6和IL-10的蛋

13、白合成，IL-8水平在兩組中無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1. IL-6基因多態(tài)性與腦癱的易感性相關(guān)，以與性別相關(guān)聯(lián)的方式參與了腦癱的發(fā)病過程，并與男性腦癱患兒中PVL的形成有關(guān)。
　　2. IL-6和IL-10的基因多態(tài)性可影響外周血IL-6及IL-10相應(yīng)蛋白水平，參與腦癱的發(fā)生發(fā)展，IL-10和IL-17A基因多態(tài)性與痙攣型四肢癱相關(guān)。
　　第二部分表皮葡萄球菌感染在未成熟腦損傷中的作用<

14、br>　　目的:
　　采用1日齡新生小鼠，通過頸外靜脈注射表皮葡萄球菌（SE）建立炎癥性腦損傷模型，探討SE感染造成未成熟腦損傷的可能機制。
　　方法:
　　采用1日齡C57BL/6J野生型（WT）和TLR2基因敲除（TLR2-/-）小鼠，通過頸外靜脈注射活SE，建立SE感染模型，所有注射動物隨機分為SE組和無菌生理鹽水（Saline）對照組。不同時間點處死取外周血、腦脊液（CSF）、腦組織、肝臟及脾臟等組織勻漿后進行

15、細菌培養(yǎng)并觀察細菌菌落計數(shù)（CFUs）；Luminex技術(shù)測定外周血和腦組織的細胞因子，觀察外周和中樞炎癥反應(yīng)情況；基因芯片技術(shù)測定TLR信號通路相關(guān)基因，觀察TLR信號基因的表達情況；取腦組織進行MAP-2和MBP免疫組化染色，評估腦損傷程度。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠體內(nèi)的SE清除情況：
　?。?）在WT小鼠中，外周血及器官組織的CFUs在SE注射后4小時最高，隨著時間延長逐漸下降，在注射后48小時基本消失；

16、>　?。?）在TLR2-/-小鼠中，外周血及器官組織的CFUs在SE注射后的各時間點均高于WT小鼠，并延遲至注射后72小時才基本消失；
　?。?）CSF于任何時間點均未檢測出CFU。
　　2. SE感染對小鼠外周及腦組織炎癥因子的影響：
　?。?）注射后6小時，WT和TLR2-/-小鼠各自外周血IL-6, CCL2, CXCL1和IL-12p40水平在SE組中均明顯高于Saline對照組，且SE注射后，TLR2-/-小

17、鼠外周血CCL2和IL-12p40水平顯著高于WT小鼠；
　?。?）注射后6小時，WT和TLR2-/-小鼠各自腦勻漿中僅CCL2水平在SE組明顯高于Saline對照組，而其它細胞因子水平未見明顯變化（P＞0.05）。
　　3.SE感染對體循環(huán)及神經(jīng)系統(tǒng)白細胞（WBC）募集的影響：
　?。?）注射后6小時，WT和TLR2-/-小鼠各自外周血及CSF的WBC計數(shù)在SE組均明顯高于saline對照組；
　?。?）注射后

18、24小時，WT和TLR2-/-小鼠各自外周血及CSF的WBC計數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　4. SE感染對大腦Caspase-3活性的影響：注射后6小時，SE組與Saline對照組比較，Caspase-3活性在WT小鼠中明顯增強，而在TLR2-/-小鼠中未見明顯變化（P＞0.05）。
　　5. SE感染對大腦TLR信號通路相關(guān)基因表達的影響：在WT小鼠中，注射后：
　　（1）6小時，SE組和Saline對照

19、組比較，TLR2、干擾素調(diào)節(jié)因子-1（IRF-1）和前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）的基因表達量選擇性上調(diào)；
　　（2）24小時，SE組和Saline對照組比較，IRF-1和NFκBiβ（核轉(zhuǎn)錄因子NFκB的抑制劑）的基因表達量選擇性上調(diào)。
　　6. SE感染對腦損傷程度的影響：
　　（1）SE組和Saline對照組比較，14日齡小鼠的大腦白質(zhì)及灰質(zhì)體積在WT和TLR2-/-小鼠中均明顯減低；
　　（2）S

20、E組和Saline對照組比較，14日齡小鼠的大腦小膠質(zhì)細胞數(shù)量在WT和TLR2-/-小鼠之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論
　　1. SE感染可導致新生1日齡小鼠外周及腦組織炎癥反應(yīng)，在細菌未進入腦脊液的情況下可影響未成熟大腦的發(fā)育。
　　2. SE感染在生命早期可能通過TLR2依賴途徑參與早產(chǎn)兒腦損傷，但隨著感染時間延長，非TLR2依賴的途徑可能被激活，參與未成熟腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第三部分缺

21、氧缺血后免疫/炎癥反應(yīng)在未成熟腦損傷中的作用
　　目的:
　　采用5日齡新生小鼠，建立缺氧缺血（HI）早產(chǎn)腦損傷模型，探索缺氧缺血后細胞免疫/炎癥反應(yīng)在未成熟腦損傷中的作用。
　　方法
　　采用5日齡野生型小鼠建立HI早產(chǎn)腦損傷模型：結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，并將小鼠置于10％的氧氣分別持續(xù)缺氧50分鐘、70分鐘和80分鐘，于不同時間點處死取腦組織固定，進行硫素/品紅酸染色以及MAP-2和MBP免疫組化染色，評估小鼠腦損

22、傷程度，根據(jù)腦損傷程度選擇合適的缺氧持續(xù)時間，以更好地模擬早產(chǎn)兒腦損傷。
　　選擇合適的缺氧持續(xù)時間后，分別于不同時間點處死取腦組織，進行大腦TREM-2/DAP12、Iba-1和DAPI三重免疫熒光染色，觀察TREM-2和DAP12陽性細胞在大腦中的分布情況；并使用RT-PCR技術(shù)檢測腦組織CD4+T淋巴細胞亞群相關(guān)細胞因子的mRNA表達水平，觀察HI后的免疫/炎癥反應(yīng)狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1.HI對腦損傷程度的影

23、響：
　　（1）HI后3天，HI-50分鐘組（即持續(xù)缺氧時間為50分鐘）中僅3/12（25%）的小鼠出現(xiàn)肉眼可見腦損傷，表現(xiàn)為損傷側(cè)大腦半球海馬CA1至CA3區(qū)神經(jīng)元丟失；HI-70分鐘組中大部分小鼠13/14（93%）出現(xiàn)腦損傷，表現(xiàn)為損傷側(cè)大腦半球海馬區(qū)及白質(zhì)局灶性損傷同時存在，并伴有少量局部皮質(zhì)損傷；HI-80分鐘組中有14/16（88%）的小鼠出現(xiàn)腦損傷，其中6/16（37.5%）的小鼠損傷側(cè)大腦半球皮質(zhì)、海馬、白質(zhì)及丘腦

24、等部位出現(xiàn)更為廣泛的梗死，三組小鼠對照側(cè)大腦半球均未見明顯損傷；
　?。?）HI后7天，HI-50分鐘小鼠損傷側(cè)半腦的灰質(zhì)體積比對照側(cè)半腦明顯減少（P＜0.05），兩側(cè)半腦白質(zhì)體積無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；HI-70分鐘小鼠損傷側(cè)半腦的灰質(zhì)體積（P＜0.001）及白質(zhì)體積（P＜0.05）均比對照側(cè)半腦明顯減少；
　?。?）選用5日齡小鼠HI-70分鐘模型用于之后的分析；
　　2.HI對大腦TREM-2和DAP1

25、2表達的影響：（1）隨著HI后24小時、3天和7天時間的延長，損傷側(cè)半腦TREM-2的表達逐漸增加并于HI后24小時達到最高，且主要分布于腦實質(zhì)內(nèi)和血管壁；
　?。?）損傷側(cè)半腦DAP12的表達主要集中在皮層下白質(zhì)損傷區(qū)域、海馬、腦室周圍及腦膜等部位，且DAP12和Iba-1雙陽性細胞在HI后24小時主要分布在損傷側(cè)半腦腦室周圍，在HI后3天主要分布在損傷側(cè)海馬近血管處及腦膜部位。
　　3. HI對大腦細胞免疫/炎癥反應(yīng)的影

26、響：（1）大腦CD4+T淋巴細胞的分布：腦內(nèi)CD4+T淋巴細胞的數(shù)量在HI后24小時和7天均比同齡正常對照小鼠升高，且大部分CD4+T淋巴細胞分布在血管內(nèi)，僅少量位于腦實質(zhì)內(nèi)；
　　（2）Th1相關(guān)：損傷側(cè)半腦T-bet和IL-12a的mRNA水平在HI后6小時顯著升高；
　?。?）Th2相關(guān)：損傷側(cè)半腦IL-4基因在HI后6小時和24小時明顯下調(diào)，IL-13基因在HI后6小時明顯上調(diào)；
　?。?）Th17相關(guān)：損傷側(cè)