HCN通道在OAB發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究.pdf

1、膀胱過度活動癥（overactivebladder，OAB）是常見的膀胱功能障礙性疾病之一，臨床表現(xiàn)為尿急、尿頻甚至急迫性尿失禁等癥狀，使患者正常生活和身心健康受到極大影響，同時也使社會公共醫(yī)療系統(tǒng)的負擔日益加重。正常膀胱在儲尿期處于穩(wěn)定的狀態(tài)，而且由于良好的順應(yīng)性，在膀胱潴尿的早期都保持很低的腔內(nèi)壓，這些都有利于尿液從腎盂輸尿管向膀胱的輸送，以及避免出現(xiàn)尿液的膀胱－輸尿管反流。這個過程非常復(fù)雜，是在神經(jīng)、體液、心理意識以及自身等多種因

2、素的調(diào)控下協(xié)調(diào)統(tǒng)一完成的。但是往往會有某種因素，使得這個統(tǒng)一協(xié)調(diào)的過程遭到破壞，使得膀胱逼尿肌出現(xiàn)了不受意識控制的收縮，伴發(fā)一系列尿急、尿頻的臨床表現(xiàn)，這些表現(xiàn)被統(tǒng)稱為膀胱過度活動癥，而膀胱自發(fā)性收縮則被稱為逼尿肌過度活動（DO）是OAB的特征之一，在臨床檢查中，它可以被尿動力學(xué)檢查所記錄。OAB在歐美等發(fā)達的發(fā)病率很高，被稱為10種最常見的慢性疾病之一；目前國內(nèi)雖然沒有大規(guī)模的臨床流行病學(xué)研究報道其確切的發(fā)病率，然而就泌尿科就診的病人

3、數(shù)量來看，屬于非常常見的疾病。OAB目前尚無理想的治療辦法，常用抗膽堿能藥物由于副作用過大，限制了其臨床應(yīng)用，患者的大部分因副作用停止治療，依從性很差。因此，迫切需要尋找新的有效的治療靶點和替代療法。
　　關(guān)于OAB的發(fā)病機制已有大量文獻進行報道。綜合來看，OAB病因復(fù)雜，多種因素均參與致病，不同病因可能會導(dǎo)致OAB出現(xiàn)不同的發(fā)病機理，但確切的發(fā)病機制還遠未明了。2011版《膀胱過度活動癥診斷治療指南》提出了四種可能的發(fā)病機制：①

4、逼尿肌不穩(wěn)定；②膀胱感覺過敏；③尿道及盆底肌功能異常；④其他原因。其中以逼尿肌不穩(wěn)定最為常見，而逼尿肌不穩(wěn)定最常繼發(fā)于BOO性疾病，其中以BPH最為多見。盡管OAB病因復(fù)雜，但目前已有大量證據(jù)表明，繼發(fā)于梗阻后的膀胱ICC細胞的數(shù)量改變和逼尿肌本身功能的改變在BOO所致OAB的發(fā)生中占有極為重要的地位。
　　研究發(fā)現(xiàn)，逼尿肌細胞的興奮收縮來源于其周圍的ICC細胞，ICC細胞在對逼尿肌細胞自發(fā)性收縮起著非常關(guān)鍵的作用，近年來ICC細

5、胞在膀胱生理和病理狀態(tài)中的作用日益受到關(guān)注。在膀胱病理情況下，常常伴有膀胱間質(zhì)細胞數(shù)目、分布或功能的異常，從而引起排尿障礙疾病。例如OAB患者及動物模型中膀胱間質(zhì)細胞數(shù)量較正常組顯著增高，抑制間質(zhì)細胞的活性可減少OAB患者逼尿肌自發(fā)性電活動，且在動物實驗中抑制間質(zhì)細胞的活性還可改善豚鼠膀胱容量，提高膀胱順應(yīng)性，并減少膀胱充盈期的自發(fā)性活動。
　　雖然有關(guān)膀胱ICC細胞興奮性的研究處于初級階段，但是胃腸道ICC細胞已被發(fā)現(xiàn)存在HCN

6、通道。HCN通道是目前研究最為清楚的一種電流起搏通道。它所引起的Ih電流在細胞興奮起始過程中扮演了關(guān)鍵的角色，和多種細胞的興奮性增加有關(guān)。因此我們猜想OAB膀胱中逼尿肌不自主收縮可能和OAB膀胱ICC細胞上HCN通道變化有關(guān)。HCN通道變化引發(fā)膀胱儲尿期異常放電，導(dǎo)致膀胱異常收縮。而藥物抑制間質(zhì)細胞的活性可減少OAB患者逼尿肌自發(fā)性電活動，實際上是減少了ICC細胞上HCN通道表達。為此，我們以ICC細胞上的HCN通道為切入點，研究HCN

7、通道在OAB發(fā)生過程中的作用及機制。
　　本課題主要包括以下三部分：
　　第一部分：HCN通道在人和大鼠膀胱分布和表達
　　選用正常人膀胱組織和正常大鼠膀胱組織進行研究，采用組織免疫熒光和Westernblot等方法來檢測HCN1、2、3、4通道在人膀胱粘膜、粘膜下層、肌層和大鼠粘膜、粘膜下層、肌層的表達。在實驗過程中，我們還無意中發(fā)現(xiàn)了vimentin和HCN4雙標的肥大細胞。
　　主要結(jié)果:
　　1．人

8、膀胱的免疫熒光檢測結(jié)果表明：c-kit陽性ICC細胞在無論在人膀胱的粘膜下層和肌層都不多見，vimentin陽性ICC細胞廣泛分布于人膀胱的粘膜下層和肌層。提示vimentin可以作為人膀胱ICC細胞的可靠標志物。
　　2．人膀胱的免疫熒光檢測結(jié)果表明：膀胱的ICC細胞主要分布于膀胱的粘膜下層和肌層。肌層中ICC細胞可以分布于肌膜周圍，也可以分布在肌細胞間隙。
　　3．人膀胱的免疫熒光檢測結(jié)果表明：HCN4陽性ICC細胞分布

9、于膀胱的粘膜下層和肌層中。粘膜下層HCN4陽性的ICC細胞可能和膀胱壁的信息傳遞有關(guān)，肌層中HCN4陽性的ICC細胞可能和膀胱自發(fā)性收縮有關(guān)。
　　4．人膀胱的免疫熒光檢測結(jié)果表明：粘膜下層還存在HCN4和vimentin雙標陽性的肥大細胞，其作用可能和肥大細胞內(nèi)細胞因子和活性物質(zhì)的釋放有關(guān)。
　　5．大鼠膀胱的免疫熒光檢測結(jié)果表明：c-kit陽性ICC細胞廣泛分布于大鼠膀胱的粘膜下層和肌層。提示c-kit可以作為大鼠膀胱I

10、CC細胞的可靠標志物。Vimentin和c-kit對人和大鼠染色結(jié)果不同可能和種屬有關(guān)。
　　6．大鼠膀胱的免疫熒光檢測結(jié)果表明：HCN4陽性ICC細胞分布于膀胱的粘膜下層和肌層中。
　　7．IPP軟件的熒光強度檢測后結(jié)果分析提示：無論是人還是大鼠粘膜下層HCN4通道表達明顯高于其他亞型。
　　8．Westernblot檢測后結(jié)果分析提示：無論是人還是大鼠肌層HCN4通道表達明顯高于其他亞型。
　　結(jié)論:

11、　　1．HCN1、2、3、4通道在人和大鼠膀胱ICC細胞上都有表達。
　　2．HCN4通道在人和大鼠膀胱ICC細胞上表達要高于其它亞型。
　　3．人膀胱粘膜下層存在HCN4和vimentin雙標陽性的肥大細胞。
　　第二部分：HCN4通道OAB膀胱中分布和表達
　　選用OAB大鼠模型中不同手術(shù)組（4周、6周、8周）進行對比研究，以正常大鼠膀胱組織作為對照。采用組織免疫熒光和Westernblot方法來檢測不同模型

12、組中HCN4通道在粘膜下和肌層的表達變化。然后對各組中膀胱ICC細胞進行體外培養(yǎng)，利用細胞免疫熒光檢測HCN4通道的分布變化。
　　主要結(jié)果:
　　1．大鼠OAB模型膀胱尿動力檢測結(jié)果提示：自發(fā)性收縮頻率在膀胱出口部分梗阻后明顯增多，并且8周組明顯高于其他組。
　　2．OAB大鼠不同組的免疫熒光檢測結(jié)果表明：ICC細胞在膀胱出口部分梗阻后明顯增多，提示ICC細胞增多是OAB病理變化重要部分。
　　3．OAB大鼠不

13、同組的免疫熒光檢測結(jié)果表明：HCN4通道在梗阻后明顯增多，HCN4通道增多和ICC細胞增多存在正相關(guān)。
　　4．IPP軟件的組織熒光強度檢測后統(tǒng)計結(jié)果分析提示：膀胱出口部分梗阻后粘膜下層ICC細胞和HCN4通道同時增加，并且8周組明顯高于其他組。
　　5．Westernblot檢測后統(tǒng)計結(jié)果分析提示：膀胱出口部分梗阻后肌層ICC細胞和HCN4通道同時增加，并且8周組明顯高于其他組。提示HCN4通道增多和OAB自發(fā)性收縮頻率呈

14、正相關(guān)。
　　6．IPP軟件的細胞熒光強度檢測后統(tǒng)計結(jié)果分析提示：同組織檢測結(jié)果相似，膀胱出口部分梗阻后ICC細胞和HCN4通道同時增加，并且8周組明顯高于其他組。
　　結(jié)論:
　　1．ICC細胞和HCN4通道在OAB模型中明顯增多。
　　2．HCN4通道增多和OAB自發(fā)性收縮頻率呈正相關(guān)。
　　第三部分：HCN4通道OAB發(fā)病過程中的機制研究
　　選用OAB大鼠模型中不同手術(shù)組（4周、8周）的膀胱進

15、行細胞培養(yǎng)，對各組中ICC細胞進行膜片鉗檢測，以正常大鼠膀胱ICC細胞作為對照。記錄各組ICC細胞Ih電流改變情況。
　　主要結(jié)果:
　　1．正常逼尿肌細胞和ICC細胞膜片鉗檢測結(jié)果提示：逼尿肌上未記錄到內(nèi)向電流，ICC細胞可記錄到Ih電流出現(xiàn)。提示ICC細胞極有可能是膀胱興奮性起源細胞。
　　2．OAB大鼠不同組的ICC細胞膜片鉗檢測結(jié)果提示：在OAB模型組，Ih電流密度明顯增加，8周組明顯高于其他組。HCN4通道增

16、加和Ih電流密度呈正相關(guān)。
　　3．OAB大鼠不同組的ICC細胞膜片鉗檢測結(jié)果提示：在OAB模型組，ICC細胞Ih電流密度增加，這可能是ICC細胞興奮頻率增加的原因。
　　結(jié)論:
　　1．ICC細胞可記錄到Ih電流，其可能是膀胱的起搏細胞。
　　2．OAB模型中ICC細胞的Ih電流密度明顯高于正常。ICC細胞興奮頻率的增加可能是Ih電流密度增加引起的。
　　主要結(jié)論
　　一．HCN1、2、3、4通道在