宮內(nèi)感染-炎癥后未成熟腦星形細胞膠質(zhì)化的作用及機制研究.pdf

1、腦白質(zhì)損傷(White matter damage,WMD)是早產(chǎn)兒最重要的腦損傷,其病理特點主要是腦白質(zhì)損傷部位出現(xiàn)反應性星形細胞膠質(zhì)化、小膠質(zhì)細胞浸潤、少突膠質(zhì)細胞損傷和髓鞘損害以及軸突損傷等。宮內(nèi)感染／炎癥、早產(chǎn)和早產(chǎn)兒腦白質(zhì)密切相關(guān),而且神經(jīng)膠質(zhì)細胞和炎癥信號在宮內(nèi)感染／炎癥導致的腦損傷中起重要作用。宮內(nèi)感染后腦內(nèi)炎癥反應影響未成熟星形細胞的增殖和膠質(zhì)化是腦白質(zhì)損傷的關(guān)鍵之一,Toll-like受體-4(TLR-4)／核因子κB

2、(NF-κB)信號和Notchl／Hes信號可能參與宮內(nèi)感染／炎癥后未成熟星形細胞的增殖和膠質(zhì)化機制。本研究通過建立宮內(nèi)感染的大鼠模型,研究宮內(nèi)感染／炎癥后未成熟腦星形細胞增殖和膠質(zhì)化的時空性；以及通過星形細胞培養(yǎng),研究感染／炎癥對未成熟星形細胞增殖和膠質(zhì)化的影響和TLR-4／NF-κB及Notchl／Hes信號是否參與這一過程；而且予茶多酚(TP-EGCG)干預,探討TP-EGCG對感染／炎癥后未成熟星形細胞增殖和膠質(zhì)化行為的作用及是

3、否影響星形細胞TLR-4／NF-κB及Notchl／Hes信號等,從炎癥和發(fā)育信號角度進一步說明宮內(nèi)感染／炎癥后未成熟星形細胞的損傷機制,為將來防治早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 研究宮內(nèi)感染／炎癥后不同時間腦內(nèi)不同部位(腦室旁白質(zhì)、海馬、胼胝體和皮層)星形細胞的增殖特點,探討感染／炎癥對未成熟星形細胞增殖和膠質(zhì)化的影響以及TLR-4、NF-κBp65和細胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、

4、MIP-1β等)的表達特點以及Notch1信號的表達變化,研究TP-EGCG對感染／炎癥后未成熟星形細胞增殖和膠質(zhì)化行為的作用及這一作用是否影響炎癥信號及Notch1信號。
　　 方法:
　　 1.動物模型:官內(nèi)感染組孕15天母鼠宮頸左右兩側(cè)各注射大腸桿菌稀釋液0.2 mL,對照組注入等量生理鹽水。取新生1、3、7、14、21日齡大鼠腦組織,測定各時點仔鼠體重、腦重,蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化方法研究新生1、3、

5、7、14、21日齡大鼠腦白質(zhì)組織病理特點和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達變化。
　　 2.星形細胞培養(yǎng):不同濃度脂多糖(LPS:1μg／mL、5μg／mL、10μg／mL)刺激不同時間(1、3、7天)后,免疫熒光法檢測星形細胞GFAP+／BrdU+的表達變化,觀察星形細胞增殖活性的變化,ELISA法檢測星形細胞培養(yǎng)液細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-10等)濃度變化,同時熒光定量RT-PCR法檢測LPS刺激后星形細胞T

6、LR-4、NF-κB以及細胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β)mRNA的表達變化,以及Notch1、Hes1、Hes5 mRNA的表達變化。
　　 3.TP-EGCG干預:以LPS(5μg／mL)刺激1天和3天,同時予TP-EGCG干預后,免疫熒光法檢測GFAP+／BrdU+表達變化；以及熒光定量RT-PCR法檢測星形細胞TLR-4、NF-κB以及細胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1

7、β)mRNA的表達變化和Notch1、Hes1、Hes5 mRNA的表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.宮內(nèi)感染組子宮及胎盤內(nèi)血管充血、水腫,并見大量中性粒細胞浸潤,宮內(nèi)感染組新生1日齡(P1)仔鼠體重和腦重均較同日齡對照組減輕(P<0.05)。宮內(nèi)感染組與對照組P1和P3大鼠僅腦室旁腦白質(zhì)區(qū)可見少許GFAP陽性細胞,兩組比較差異無顯著意義(P>0.05)；官內(nèi)感染組P7大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)GFAP陽性細胞胞漿明顯、

8、突起增多,細胞數(shù)量多于對照組(P<0.05)；官內(nèi)感染組P14大鼠腦室旁白質(zhì)、肼胝體和皮層區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)量多于對照組(P<0.01)；兩組P21大鼠各腦區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。
　　 2.LPS(10μg／mL)刺激早期GFAP+／BrdU+細胞數(shù)與對照組比較減少(P<0.05),而LPS(5μg／mL)刺激后GFAP+／BrdU+細胞數(shù)較對照組增加(P<0.05)。LPS(5μg／mL)刺激早期

9、星形細胞培養(yǎng)液TNF-α、IL-1β濃度較對照組升高明顯(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激1天時星形細胞TLR-4 mRNA表達較對照組降低明顯(P<0.05),而LPS(5μg／mL)刺激3天時星形細胞TLR-4 mRNA表達升高(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激3天時星形細胞NF-κBp65 mRNA表達減少(P<0.05),而LPS(5μg／mL和10μg／mL)刺激7天時NF-κBp65 mRNA表達均較對照

10、組升高(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激后星形細胞Notch1 mRNA表達較對照組下降(P<0.05),但LPS(10μg／mL)刺激1天、LPS(5μg／mL)刺激7天時Notch1 mRNA表達升高(P<0.05)。LPS(10μg／mL)刺激1天、LPS(1μg／mL)刺激7天時Hes1 mRNA表達減少(P<0.05),而LPS(1μg／mL)刺激早期星形細胞Hes5 mRNA表達增加與對照組比較有明顯差異(P<0.

11、05)。
　　 3.予TP-EGCG干預后星形細胞GFAP+／BrdU+細胞數(shù)較LPS組下降(P<0.05),且與對照組比較差異不明顯(P>0.05)。LPS組與LPS+EGCG組比較星形細胞TLR-4mRNA表達差異無意義(P>0.05),但兩組比較星形細胞NF-κBp65 mRNA表達減少均差異有意義(P<0.05),而兩組比較星形細胞TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β mRNA表達差異均無意義(P>0.05

12、)。LPS組與LPS+EGCG組星形細胞Notch1、Hes1 mRNA表達差異有意義(P<0.05),但兩組比較星形細胞Hes5 mRNA表達差異無意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.官內(nèi)感染／炎癥后未成熟腦不同腦區(qū)不同日齡的GFAP表達呈一定的時空性,表明宮內(nèi)感染／炎癥可能改變未成熟腦星形細胞的功能。
　　 2.不同的感染／炎癥條件下對未成熟星形細胞的增殖活性影響是不同的,LPS刺激后星形細胞細胞

13、因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β、IL-10等)存在短暫的表達增加現(xiàn)象,且不同的感染／炎癥條件下TLR-4／NF-κB及Notch1／Hes信號的表達特點是不同的。
　　 3.TP-EGCG對LPS刺激3天后的星形細胞增殖能力有一定的改變,但對TLR-4 mRNA及細胞因子的表達變化影響不明顯,TP-EGCG對感染／炎癥時星形細胞NF-κBp65 mRNA表達抑制有改善作用,而且TP-EGCG對感染／炎癥