Reptin在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用的初步研究.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其致死率高居全球腫瘤相關(guān)致死率的第二位。中國是胃癌高發(fā)區(qū)，目前胃癌已成為中國第三大常見腫瘤，胃癌被發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)是晚期，且常伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移、腹腔種植性轉(zhuǎn)移等，患者預(yù)后不良，五年生存率很低。因此，揭示胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效的藥物靶點(diǎn)對于干預(yù)和阻斷胃癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的理論價(jià)值和臨床意義。
　　 Reptin是AAA+ATP酶家族成員之一，具有多種生物學(xué)活性，如構(gòu)成染色質(zhì)重塑復(fù)

2、合體、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、參與DNA損傷修復(fù)和調(diào)節(jié)端粒酶活性等。研究發(fā)現(xiàn)，Reptin的異常表達(dá)與腫瘤形成密切相關(guān)。研究顯示，Reptin在結(jié)直腸癌，肝細(xì)胞肝癌，膀胱癌，非小細(xì)胞肺癌，以及各種急慢性白血病中過度表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。然而，Reptin在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。本研究即初步探討了Reptin在胃癌發(fā)生和進(jìn)展過程中的作用。
　　 目的:通過研究Reptin在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探討胃癌的發(fā)生機(jī)制

3、，豐富我們對Reptin致癌機(jī)制的認(rèn)識。
　　 方法:
　　 1.在組織水平上，用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測了40例胃癌及癌旁胃粘膜組織標(biāo)本中Reptin的表達(dá)水平，并確定Reptin在胃癌及癌旁胃組織中表達(dá)的差異性。
　　 2.在胃癌細(xì)胞系BGC823和MGC803中轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA和ControlsiRNA后，檢測衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-Galstaining)，觀察細(xì)胞衰老情況。另一部

4、分細(xì)胞提取總RNA和總蛋白，分別做QRT-PCR和Westernblotting檢測ReptinmRNA水平及蛋白水平的表達(dá)，驗(yàn)證干擾效果。
　　 3.在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS，BGC823和HGC27中轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA和ControlsiRNA后，從每種處理組中取300個(gè)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)10天，觀察細(xì)胞形成的克隆，染色并計(jì)數(shù)，比較細(xì)胞形成克隆的能力，評價(jià)Reptin對胃癌細(xì)胞克隆形成能力的作用。
　　 4.在胃癌細(xì)胞系

5、BGC823和MGC803中轉(zhuǎn)入ReptinsiRNA和ControlsiRNA后，取5×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行Transwell基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)，穿過小室的細(xì)胞行結(jié)晶紫染色并鏡下計(jì)數(shù)，分析Reptin對胃癌細(xì)胞體外侵襲能力的影響。
　　 5.在胃癌細(xì)胞系BGC823和MGC803中轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA和ControlsiRNA后，分別提取細(xì)胞總RNA，和提取細(xì)胞蛋白，分別作RT-PCR、QRT-PCR及Westernblotti

6、ng檢測Reptin對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子E-cadherin、Vimentin、和Snail表達(dá)的影響。
　　 6.將轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA及ControlsiRNA的BGC823細(xì)胞分別皮下注入裸鼠體內(nèi)，觀察裸鼠皮下腫瘤的形成和生長情況。4周后麻醉處死裸鼠，分離腫瘤組織，凍于-80℃冰箱用于檢測ReptinmRNA的表達(dá)。
　　 7.將轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA及ControlsiRNA的BGC823細(xì)胞分別經(jīng)

7、尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)，5周后麻醉處死裸鼠，解剖肺臟，清洗后電子天平稱肺質(zhì)量，并觀察肺表面及實(shí)質(zhì)內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移灶情況。肺組織用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行HE染色，以備組織病理學(xué)檢查。
　　 結(jié)果:
　　 1.組織水平檢測中，Reptin在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胃粘膜組織中的表達(dá)。
　　 2.QRT-PCR和Westernblotting顯示，轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA的人胃癌細(xì)胞BGC823和MGC80

8、3中ReptinmRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色表明，在胃癌細(xì)胞系BGC823和MGC803中干擾Reptin表達(dá)后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。
　　 3.克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS，BGC823和HGC27中轉(zhuǎn)入ReptinsiRNA72小時(shí)后，細(xì)胞的克隆形成能力受到顯著抑制。
　　 4.Transwell實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA的人胃癌細(xì)胞BGC823和MGC803相比于對照

9、組侵襲到下層的細(xì)胞數(shù)顯著減少。
　　 5.將ReptinsiRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞BGC823和MGC803后，RT-PCR和QRT-PCR檢測結(jié)果顯示，干擾Reptin表達(dá)后，Vimentin及Snail的mRNA水平顯著降低，E-cadherin則無明顯變化。Westernblotting檢測顯示E-cadherin的蛋白水平有所升高，Vimentin和Snail的蛋白水平顯著降低。
　　 6.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中干擾R

10、eptin的BGC823細(xì)胞相對于對照細(xì)胞在裸鼠皮下形成腫瘤的能力明顯降低，腫瘤的體積明顯減小。QRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA組裸鼠腫瘤組織中的ReptinmRNA水平明顯降低。
　　 7.裸鼠尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，干擾Reptin的BGC823細(xì)胞在裸鼠肺表面及實(shí)質(zhì)內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移灶明顯少于對照組。HE染色鏡下可見轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA組瘤體較小;而對照組瘤體較大。
　　 結(jié)論:
　　 R

11、eptin在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于其在癌旁胃粘膜組織中的表達(dá)。在胃癌細(xì)胞系中降低Reptin的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象，顯著抑制細(xì)胞的克隆形成能力和胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。并且抑制Reptin的表達(dá)顯著降低了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子Vimentin和SnailmRNA及蛋白水平的表達(dá)，并能夠明顯升高上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin的蛋白表達(dá)。以上在胃癌細(xì)胞系中進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)提示，Reptin能夠通過影響以上生物學(xué)行為促進(jìn)胃癌