SMYD3對雌激素代謝酶轉錄調節(jié)作用機制分析.pdf

1、組蛋白甲基化酶SMYD3(SET and MYND domain-containing protein3)是乳腺癌等癌癥中的重要調控因子，而雌激素信號通路的異常活躍以及雌激素代謝產物亦與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。然而，關于SMYD3在雌激素代謝中的作用，迄今為止尚未見有相關報道。鑒于此，本論文圍繞SMYD3對CYP1A1、CYP1B1兩種雌激素Ⅰ相代謝酶的轉錄調控作用機制，加以較為系統(tǒng)的研究，以期為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、預防治療、合理用藥及

2、新藥研發(fā)提供新的理論基礎。
　　本文首先用不同濃度的17β-雌二醇(E2)對人乳腺癌細胞MCF-7進行處理，RT-PCR、Western blot分析發(fā)現CYP1A1、CYP1B1的表達量均可隨E2濃度的增加呈現劑量依賴性的上調。在采用RNA干擾特異性抑制內源性SMYD3表達后，CYP1A1、CYP1B1的轉錄表達均進一步顯著上升，同時高效液相色譜(HPLC)分析也證實細胞培養(yǎng)液中E2的殘留量隨之減少，而細胞內E2代謝產物2OH-

3、E2及4OH-E2的產生量則相應增多。此外，Real time RT-PCR及免疫組織化學分析表明SMYD3在乳腺癌細胞及組織中的表達量均明顯高于正常乳腺細胞及癌旁組織，而CYP1A1、CYP1B1的表達水平則與SMYD3的表達量呈明顯的負相關。這些結果表明:SMYD3可下調乳腺癌細胞中CYP1A1、CYP1B1的轉錄表達，并因此抑制雌激素的Ⅰ相代謝反應。
　　接下來，通過對CYP1A1、CYP1B1啟動子區(qū)域序列分析，發(fā)現二者均

4、含有多個SMYD3結合位點(SBE)。熒光素酶報告分析及染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗結果顯示，SMYD3可與CYP1A1啟動子區(qū)-281位的SBE及CYP1B1啟動子區(qū)-21位的SBE結合，增強該區(qū)域的組蛋白H4K20甲基化修飾水平。將甲基化功能缺失的SMYD3突變體(SMYD3△NHSE)轉染到MCF-7細胞中后，Real time RT-PCR分析顯示SMYD3對CYP1A1的轉錄抑制作用基本解除，而對CYP1B1的轉錄抑制作用

5、則部分解除。表明SMYD3對CYP1A1的轉錄抑制作用主要是通過催化CYP1A1啟動子-281位SBE區(qū)域的組蛋白H4K20發(fā)生甲基化而產生的，而其對CYP1B1的轉錄抑制除了催化CYP1B1啟動子區(qū)-21位SBE區(qū)域的組蛋白H4K20甲基化外，還存在其它機制。
　　結合本課題組前期的miRNA表達譜芯片結果及生物信息學分析，發(fā)現在CYP1B1的3'UTR中存在有SMYD3下游靶基因miR-200c的結合位點(MRE)，利用熒光素