中鏈脂肪酸對(duì)肥胖小鼠脂代謝的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　1.證實(shí)中鏈脂肪酸(MCFA)具有效降低高脂肪飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠體重、改善脂代謝的作用。
　　2.探討MCFA上述作用的可能機(jī)制、作用通路及靶點(diǎn),為進(jìn)一步研究MCFA調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝的作用提供理論依據(jù)。
　　3.探討辛酸和癸酸單體對(duì)高脂肪飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠體重、體脂肪及脂代謝的影響。
　　方法
　　1.C57BL/6J小鼠肥胖模型的建立
　　4-5周齡C57BL/6J雄性小鼠100只,普通飼料

2、適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,按空腹體重隨機(jī)選擇15只小鼠設(shè)為對(duì)照組(control),喂飼普通飼料(AIN-96G),其余小鼠喂飼高脂飼料(脂肪占總重量19.42％,產(chǎn)熱比40.5%)。喂養(yǎng)4周后,在高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠中,選擇體重高于對(duì)照組平均體重10%的個(gè)體,進(jìn)行體重分布分析,在分布頻率峰值范圍內(nèi)隨機(jī)選取小鼠15只,設(shè)為肥胖組(HFD-1);采用同樣方法在剩余小鼠中隨機(jī)選取15只,設(shè)為肥胖抵抗組(HFD-2)。對(duì)3組小鼠進(jìn)行體長(zhǎng)、Lee’s指數(shù)、

3、BMI、體重增長(zhǎng)值、肝臟重、腸系膜周圍脂肪墊、附睪周圍脂肪墊及腎周脂肪墊重量以及血清葡萄糖、TG、TC、HDL-C和LDL-C測(cè)定,計(jì)算HDL-C/LDL-C比值,同時(shí)取部分附睪周圍脂肪組織固定進(jìn)行HE染色。在喂養(yǎng)4周內(nèi),每周測(cè)空腹體重一次,每隔1天更換墊料和水,稱量飼料消耗量,并計(jì)算食物功效比。
　　2.MCFA對(duì)C57BL/6J肥胖小鼠脂代謝的調(diào)節(jié)作用
　　按第一部分實(shí)驗(yàn)方法復(fù)制肥胖小鼠模型,將復(fù)制成功的肥胖小鼠分三部分

4、進(jìn)行急性灌胃實(shí)驗(yàn)、短期灌胃實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
　　(1)急性灌胃實(shí)驗(yàn)
　　將36只建模成功的肥胖C57BL/6J小鼠按空腹體重隨機(jī)分為2組,每組18只,分別灌胃含有MCFA的油脂(MCT)和含有LCFA的油脂(LCT),劑量為2mg/kg,兩組分別于灌胃后1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)各處死6只,取腹主動(dòng)脈血測(cè)血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C,并計(jì)算HDL-C/LDL-C比值。
　　(2)短期灌胃實(shí)驗(yàn)
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5、只C57BL/6J肥胖小鼠按空腹體重隨機(jī)分為兩組,每組12只,分別灌胃MCT和LCT,劑量為2mg/kg,每日灌胃1次,持續(xù)2周。在實(shí)驗(yàn)期間以高脂飼料喂飼動(dòng)物,每隔1日進(jìn)行飼料消耗量的稱量和記錄,并計(jì)算食物功效比。2周后,稱量小鼠空腹體重后,麻醉小鼠,測(cè)量小鼠體長(zhǎng),計(jì)算Lee’s指數(shù)、BMI和體重增長(zhǎng)值。取腹主動(dòng)脈血處死小鼠,測(cè)量血清TG、TC、HDL-C和LDL-C,計(jì)算HDL-C/LDL-C比值。同時(shí)取小鼠肝臟、腸系膜周圍脂肪墊、附

6、睪周圍脂肪墊及腎周脂肪墊并稱重。另取部分肝臟組織制作勻漿,測(cè)定蛋白濃度以及TG、TC、ApoA1和ApoB濃度,并計(jì)算ApoA1/ApoB比值。
　　(3)長(zhǎng)期喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
　　30只C57BL/6J肥胖小鼠按空腹體重隨機(jī)分為兩組,每組15只,分別給予含2%MCT和LCT的高脂飼料喂養(yǎng),12周后結(jié)束實(shí)驗(yàn),測(cè)定指標(biāo)同短期實(shí)驗(yàn)。同時(shí),取部分附睪周圍脂肪組織固定進(jìn)行HE染色。
　　3.MCFA調(diào)節(jié)C57BL/6J肥胖小鼠脂代謝的

7、機(jī)制研究
　　在上述長(zhǎng)期喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用ELISA法測(cè)定血清樣本中HSL、cAMP、PKA、FFA、GLY、NADR和T3濃度。凍存部分肝臟組織和附睪周圍脂肪組織,用0.9%氯化鈉注射液按10%濃度制成組織勻漿,采用BCA法測(cè)定脂肪組織及肝臟組織蛋白濃度,采用ELISA法測(cè)定脂肪組織中HSL、ATGL、cAMP、PKA、LPL、FAS、ACC、Leptin、APN、PPAR-γ、TNF-α水平,肝臟組織中LPL、FAS、ACC

8、、ME、G6PD、Leptin、APN、PPAR-γ、TNF-α水平。采用Real-timePCR法檢測(cè)脂肪組織中HSL、ATGL、UCP2、β3-AR、Leptin、PPAR-γ、SREBP-1和C/EBP-α的mRNA表達(dá)。采用Westernblotting法檢測(cè)脂肪組織中β3-AR的蛋白表達(dá)。另外,參考FredriksonG和BelfrageP報(bào)道的方法測(cè)定血清和脂肪組織中HSL的活性。
　　4.辛酸和癸酸對(duì)C57BL/6J

9、肥胖小鼠脂代謝調(diào)節(jié)作用的比較
　　按上述長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)研究的方法,喂飼C57BL/6J肥胖小鼠含有2%辛酸(C8)、癸酸(C10)和油酸(C18)的高脂飼料,每組12只,8周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。觀察指標(biāo)包括:小鼠每周空腹體重、飼料消耗量及食物功效比、小鼠體長(zhǎng)、Lee’s指數(shù)、BMI和體重增長(zhǎng)值、小鼠肝臟及脂肪組織重、脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、小鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、HDL-C/LDL-C比值、脂肪組織中HSL、ATGL、cAMP、

10、PKA、Leptin、TNF-α、PPAR-γ水平以及HSL、ATGL、β3-AR的mRNA表達(dá),肝臟組織中ApoA1、ApoB、LPL、FAS、CYP7A1、HMGCoA、TNF-α水平以及CYP7A1和HMGCoA的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1.C57BL/6J小鼠肥胖模型的建立
　　高脂飼料喂養(yǎng)4周后,HFD-1肥胖組小鼠體重、體長(zhǎng)、Lee’s指數(shù)、BMI、體重增長(zhǎng)值、肝重及各部分脂肪組織重以及血糖、TC和L

11、DL-C水平均顯著高于HFD-2肥胖抵抗組和對(duì)照組(P<0.05),HDL-C/LDL-C比值顯著低于HFD-2組和對(duì)照組(P<0.05)。脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示HFD-1組細(xì)胞的長(zhǎng)徑和短徑均顯著大于HFD-2組和對(duì)照組(P<0.05),單個(gè)視野小型脂肪細(xì)胞數(shù)量少于HFD-2組和對(duì)照組(P<0.05)。HFD-1組的肥胖小鼠模型建立成功。
　　2.MCFA對(duì)C57BL/6J肥胖小鼠脂代謝的調(diào)節(jié)作用
　　急性灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

12、示小鼠灌胃MCT、LCT后2小時(shí)和4小時(shí),MCT組血清TG均明顯低于LCT組(P<0.05),其他血脂相關(guān)指標(biāo)未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。短期灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠體重、血脂、肝臟脂代謝指標(biāo)等,灌胃MCT與LCT2周后比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　長(zhǎng)期喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MCT飼料組小鼠體重、體長(zhǎng)、Lee’s指數(shù)、BMI、體重增長(zhǎng)值、肝臟重、腎周脂肪重、附睪周脂肪重、血脂相關(guān)指標(biāo)如血清TG、TC和LDL-C濃度均顯著低

13、于LCT組(P<0.05),血清HDL-C水平和HDL-C/LDL-C比值、小鼠肝臟組織勻漿的ApoA1濃度及ApoA1/ApoB比值,均顯著高于LCT組(P<0.05)。脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示,長(zhǎng)期喂養(yǎng)MCT飼料的小鼠脂肪細(xì)胞長(zhǎng)徑和短徑顯著低于LCT組,而單個(gè)視野平均細(xì)胞數(shù)高于LCT組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.MCFA調(diào)節(jié)C57BL/6J肥胖小鼠脂代謝的機(jī)制研究
　　喂飼MCT12周的C57BL/

14、6J小鼠,ELISA法測(cè)定結(jié)果顯示,與脂肪動(dòng)員相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)如血清HSL和NADR水平,肝臟組織LPL水平,脂肪組織中ATGL、HSL和cAMP水平顯著高于LCT組(P<0.05),其他指標(biāo)如血清FFA濃度,脂肪組織中FAS、Leptin和TNF-α水平顯著低于LCT組(P<0.05),PPAR-γ水平及肝臟中FAS、ACC、Leptin、APN及TNF-α水平兩組之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。mRNA表達(dá)測(cè)定結(jié)果顯示:小鼠脂

15、肪組織中ATGL、HSL、UCP2和β3-AR的mRNA表達(dá)量均顯著高于LCT組(P<0.05),Leptin、SREBP-1和C/EBP-α的mRNA表達(dá)量均顯著低于LCT組,PPAR-γmRNA表達(dá)兩組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Westernblotting測(cè)定結(jié)果顯示,MCT組β3-AR蛋白表達(dá)顯著高于LCT組(P<0.01)。此外,MCT組脂肪組織中HSL活性顯著高于LCT組(P<0.01),而血清中HSL活性,兩組之間

16、比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　4.MCFA不同單體對(duì)C57BL/6J肥胖小鼠脂代謝調(diào)節(jié)作用的比較
　　C57BL/6J小鼠喂飼分別含有C8、C10和C18脂肪酸的飼料8周后,C10組小鼠體重、Lee’s指數(shù)、BMI、體重增長(zhǎng)值、附睪周圍脂肪組織重均顯著低于C18組(P<0.05),脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示,C10組脂肪細(xì)胞體積明顯減小,與C18組比較,細(xì)胞長(zhǎng)徑和短徑均顯著降低,而單個(gè)視野平均細(xì)胞數(shù)高于C18組(P

17、<0.05),且與甘油三酯代謝相關(guān)指標(biāo)如血清TG、脂肪組織中ATGL、HSL、cAMP水平均顯著高于C18組(P<0.05),Leptin和TNF-α水平以及肝臟中FAS水平均顯著低于C18組(P<0.05)。此外,脂肪組織中ATGL、HSL和β3-AR的mRNA表達(dá)量均顯著高于C18組(P<0.05)。
　　C8組與C18組比較,主要體現(xiàn)在與膽固醇代謝相關(guān)指標(biāo)存在顯著性差異,如血清TC和LDL-C濃度低于C18組(P<0.05)

18、,血HDL-C/LDL-C比值,肝臟組織中ApoA1濃度、ApoA1/ApoB比值和CYP7A1水平均顯著高于C18組(P<0.05)。此外,C8組與C10、C18組分別比較,肝臟中CYP7A1的mRNA表達(dá)量均顯著增高(P<0.05),而HMGCoA的mRNA表達(dá)量,三組之間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論
　　1.MCFA作為天然來(lái)源的小分子中鏈脂肪酸可有效減輕肥胖小鼠體重,減少機(jī)體脂肪聚集,改善血甘油三脂、

19、血膽固醇水平。
　　2.以上作用的可能機(jī)制為:
　　(1)MCFA由于其獨(dú)特的代謝途徑增加機(jī)體能量消耗,進(jìn)而作用于中樞增加交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性,使外周NADR釋放增加,激活脂肪細(xì)胞膜上的β3-AR,導(dǎo)致UCP2的表達(dá)增加,增強(qiáng)了與甘油三酯代謝相關(guān)酶ATGL、HSL的表達(dá)活性和水平,使體內(nèi)脂肪動(dòng)員加速,進(jìn)而促進(jìn)脂肪組織分解。
　　(2)這種激活機(jī)體能量代謝的作用不是通過(guò)激活Leptin表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　(3)MCFA

20、可能通過(guò)下調(diào)脂肪組織中TNF-α、SREBP-1及C/EBP-α水平和mRNA表達(dá),抑制脂肪細(xì)胞分化途徑,減少脂肪細(xì)胞聚集,進(jìn)而改善機(jī)體脂代謝紊亂。
　　(4)MCFA對(duì)肝臟中脂肪酸合成途徑的調(diào)節(jié)、對(duì)肝臟中脂肪因子的調(diào)節(jié)、以及MCFA對(duì)Leptin、APN和PPAR-γ途徑的調(diào)節(jié)作用并不確定。
　　3.MCFA中的辛酸和癸酸均可有效改善肥胖小鼠血甘油三酯和血膽固醇水平,但辛酸主要通過(guò)增加肝臟CYP7A1的表達(dá)調(diào)節(jié)小鼠膽固醇代