糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞糖原代謝的雙向調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本文采用“兩步灌流法”分離大鼠肝細(xì)胞，于William's E Medium+10％FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、白蛋白(Alb)及尿素(Ureal)含量；糖苷酶降解結(jié)合己糖激酶法葡萄糖測(cè)定檢測(cè)GCs對(duì)大鼠肝細(xì)胞內(nèi)糖原含量的影響；酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析法檢測(cè)GCs對(duì)大鼠肝細(xì)胞糖原代謝的關(guān)鍵酶糖原磷酸化酶和糖原合酶活性的影響；放射免疫分析法檢測(cè)GCs對(duì)大鼠

2、肝細(xì)胞胞內(nèi)cAMP水平的影響；Fluo-3/AM熒光掃描技術(shù)檢測(cè)GCs對(duì)大鼠肝細(xì)胞胞漿游離鈣濃度[Ca<'2+>]i的影響。研究工作取得的主要結(jié)果如下： 1．通過形態(tài)學(xué)及臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定，分離的肝細(xì)胞胞膜完整，呈球形或橢球形，存活率在90％以上。培養(yǎng)后貼壁牢固，生長狀態(tài)良好，生化檢測(cè)培養(yǎng)上清液中LDH、白蛋白、尿素水平顯示，損傷逐漸恢復(fù)，合成及分泌功能良好，說明該方法是比較理想的肝細(xì)胞培養(yǎng)法，為實(shí)驗(yàn)研究提供了穩(wěn)定的細(xì)胞模型平臺(tái)。

3、 2．地塞米松處理原代培養(yǎng)肝細(xì)胞24 h，低濃度(10<'-10>-10<'-9>M) GCs可顯著增加肝細(xì)胞糖原含量，而較高濃度(10<'-8>-10<'-5>M)則顯著降低肝細(xì)胞糖原含量，并呈劑量依賴性?？紤]到高濃度GCs細(xì)胞毒作用的可能，采用Cell Counting Kit-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果也排除了細(xì)胞毒作用可能的影響。 3．以10<'-6>M地塞米松處理原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)糖原含量的變化，發(fā)現(xiàn)2 h

4、后地塞米松處理組較對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)糖原含量顯著降低，48 h后逐漸恢復(fù)并于72 h后高于對(duì)照組。蛋白合成抑制劑放線菌酮不能阻斷地塞米松的降低糖原含量作用(6 h)。 4．以10<'-6>M地塞米松處理原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，15 min后細(xì)胞內(nèi)糖原磷酸化酶α活性處理組較對(duì)照組顯著增高，2 h后逐漸恢復(fù)并于6 h及其以后低于對(duì)照組，而糖原合酶活性在6 h及24 h顯著降低。 5．以10<'-6>M地塞米松處理原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，胞內(nèi)cAM

5、P水平在6 h及24 h顯著升高，地塞米松還能在數(shù)秒內(nèi)迅速升高肝細(xì)胞[Ca<'2+>]i水平。 以上結(jié)果表明，GCs對(duì)大鼠肝細(xì)胞的糖原代謝存在雙向調(diào)節(jié)作用，高濃度GCs在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)可以通過影響糖原磷酸化酶和糖原合酶活性而使肝細(xì)胞內(nèi)糖原含量下降。該作用可能有著非基因組機(jī)制的參與，并與GCs快速升高胞內(nèi)游離鈣以及其影響胞內(nèi)cAMP水平有關(guān)。 GCs對(duì)糖原代謝的作用是雙向的，推測(cè)該作用可能在機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中具有重要的生理意

6、義。GCs因其濃度不同作用有所差別，正常狀態(tài)下GCs能促進(jìn)肝糖原的合成，而應(yīng)激狀態(tài)下GCs在增加糖異生的同時(shí)促進(jìn)肝糖原分解以應(yīng)對(duì)機(jī)體對(duì)葡萄糖的需要。此外，GCs在應(yīng)激的不同階段也可能發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。在強(qiáng)烈應(yīng)激的早期階段，GCs可能促使儲(chǔ)備的肝糖原分解，而其后GCs促進(jìn)糖原合成補(bǔ)充急性消耗的肝糖原以防備下次應(yīng)激。 因此，本研究對(duì)GCs在糖代謝中的作用提出了新的模式，為研究GCs特別是其非基因組機(jī)制在應(yīng)激中的生理意義提供了參考依