基于HILIC-MS-MS的胚胎干細(xì)胞谷氨酸和γ-氨基丁酸的自釋放定量方法學(xué)研究.pdf

1、已發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）表達(dá)谷氨酸和γ-氨基丁酸功能性受體以及其合成和釋放的生物元件，但谷氨酸和γ-氨基丁酸本身是否能由 ESC釋放則需要特異性和靈敏度高的檢測手段予以確證。目前常用的檢測方法是色譜串聯(lián)紫外-可見光/熒光檢測法等，但由于需要衍生化處理或加入離子對(duì)試劑，容易引入雜質(zhì)并降低檢測靈敏度，從而影響結(jié)果可靠性。相比而言，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)逐漸成為氨基酸分析的主要方法之一。由于谷氨酸

2、和γ-氨基丁酸均為極性化合物，在常用的反相 C18色譜柱上不能保留，因此本研究采用新型的親水作用色譜（Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC）分離分析。該方法明顯改善極性物質(zhì)及離子性質(zhì)化合物的保留時(shí)間、擺脫了在色譜分析前端發(fā)生的質(zhì)譜離子抑制現(xiàn)象的影響、提高質(zhì)譜離子化效率、同時(shí)有效解決了極性物質(zhì)在傳統(tǒng) C18色譜柱的弱保留問題，流動(dòng)相的黏度較低也使分離速度較反相色譜快。應(yīng)用該方法發(fā)現(xiàn)ESC

3、可自分泌谷氨酸和γ-氨基丁酸直至達(dá)到平衡狀態(tài)，為干細(xì)胞的小分子調(diào)控生物學(xué)研究提供了方法學(xué)手段和數(shù)據(jù)線索。
　　本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)、替代基質(zhì)法建立了基于HILIC-MS/MS法的谷氨酸和γ-基丁酸分析方法，操作較為簡單、靈敏度較高、選擇性較強(qiáng)。從分析化學(xué)的角度直接檢測到胚胎干細(xì)胞自分泌谷氨酸和γ-氨基丁酸。
　　課題還初步討論了 HILIC色譜用于親水性、偶極化合物分析的分離機(jī)理；并探討了 LC-MS/MS色譜檢測方法在達(dá)到