宮頸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移與Pin1誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及其基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系研究.pdf

1、目的：將維吾爾族婦女的宮頸癌作為研究對(duì)象，分別從腫瘤組織學(xué)水平，細(xì)胞學(xué)水平上進(jìn)行驗(yàn)證。從而驗(yàn)證肽基脯氨酰同分異構(gòu)酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，Pin1）有可能參與了對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）誘導(dǎo)作用，以及調(diào)節(jié)上皮和間質(zhì)組織屬性基因表達(dá)水平的關(guān)系來參與宮頸癌的發(fā)生、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，并探討基于EMT的宮頸癌發(fā)病機(jī)制、預(yù)警指標(biāo)和臨床

2、治療指標(biāo)。
　　方法：⑴共收集宮頸標(biāo)本189例，其中包括：宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）116例，子宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN II）41例，正常對(duì)照組32例。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Pin1、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail1及Vimentin）蛋白質(zhì)表達(dá)水平，分析腫瘤臨床參數(shù)與上述指標(biāo)變化的關(guān)系。⑵實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)宮頸癌HeLa，SiHa，C33a細(xì)胞中Pin1 mRNA細(xì)胞的基礎(chǔ)

3、表達(dá);對(duì)于Pin1的cDNA序列，構(gòu)建短發(fā)夾RNA干擾載體（shRNA），并轉(zhuǎn)染到SiHa細(xì)胞中以建立RNAi表達(dá)細(xì)胞模型。為驗(yàn)證轉(zhuǎn)染前后Pin1 mRNA在蛋白水平的改變，進(jìn)一步通過運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western blot兩種技術(shù)，分別進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染Pin1-siRNA后，SiHa宮頸癌細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Snail1和Vimentin mRNA和蛋白水平

4、情況；⑶應(yīng)用MTT（四甲基偶氮唑鹽）法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀技術(shù)，分別分析Pin1特異性sh-RNA轉(zhuǎn)染后，宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)的改變。其中包括:細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)。
　　結(jié)果：①免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，隨著宮頸癌及癌前病變發(fā)生，Pin1蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，這些間質(zhì)組織屬性蛋白質(zhì)N-cadherin和Snail1等的表達(dá)趨勢(shì)與其一致，同樣為上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，而E-ca

5、dherin和β-catenin等這些上皮組織屬性蛋白質(zhì)表達(dá)水平卻呈下調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)，而且宮頸癌的較高臨床分期、中低組織分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也伴有上述5種蛋白質(zhì)表達(dá)水平的顯著變化(P<0.05)，可能呈現(xiàn)一種Pin1誘導(dǎo)的宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移趨勢(shì)。②Pin1 mRNA在宮頸癌的不同細(xì)胞系中，均存在不同程度的表達(dá)。在宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa和C33a這三種不同的細(xì)胞系中，表達(dá)尤為明顯的是SiHa細(xì)胞；Pi

6、n1轉(zhuǎn)染sh-RNA后，特異性的使得轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，伴隨著E-cadherin和β-連環(huán)素和其他上皮組織屬性基因表達(dá)水平有顯著增加。而這一類間質(zhì)組織屬性基因，N-cadherin、Snail1和Vimentin等表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)（P<0.05），呈現(xiàn)Pin1誘導(dǎo)的EMT相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控趨勢(shì)；根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)分析，宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖活性比Pin1 sh-RNA轉(zhuǎn)染后明顯下降（P＜0.05），細(xì)胞遷移能力下降，細(xì)胞凋亡

7、率升高，呈現(xiàn)出典型的EMT相關(guān)細(xì)胞表型。
　　結(jié)論：⑴臨床基礎(chǔ)研究顯示，宮頸癌發(fā)生、惡性轉(zhuǎn)化、中低分化和轉(zhuǎn)移可能伴有Pin1和間質(zhì)組織屬性基因表達(dá)水平上調(diào)，上皮組織基因表達(dá)下降，有一個(gè)典型的EMT發(fā)展過程。⑵根據(jù)RNAi細(xì)胞模型研究，抑制宮頸癌細(xì)胞內(nèi)Pin1表達(dá)，引起上皮組織屬性基因下調(diào)，間質(zhì)組織屬性基因表達(dá)上調(diào)，在一定程度上逆轉(zhuǎn)EMT相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞表型變化，推測(cè)Pin1可能調(diào)節(jié)上皮和間質(zhì)組織屬性基因表達(dá)調(diào)控，從而誘導(dǎo)宮頸