Hp通過Akt信號通路誘導胃粘膜細胞發(fā)生上皮間質轉化(EMT)的研究.pdf

1、背景：胃癌是全球第四大最常見的惡性腫瘤，也是我國第二大常見，是癌癥相關死亡的主要疾病因素。盡管近年來在胃癌的預防、早期診斷和治療方面取得了長足的進展，全球胃癌的發(fā)病率和死亡率均有所降低，但在我國胃癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下，每年約有17萬人死于胃癌，占所有癌癥死亡人數的1/5。目前普遍認為，Hp是慢性胃炎的病原菌，在消化性潰瘍的發(fā)生和復發(fā)中可能起重要作用。1994年世界衛(wèi)生組織/國際癌癥研究機構(WHO/IARC)將幽門螺桿菌定為Ⅰ類

2、致癌原。EMT是指在胚胎發(fā)育、腫瘤轉移或組織纖維化過程中發(fā)生的上皮細胞脫黏附而轉變成具遷移能力的間質細胞的現象，在細胞凋亡與增值、遷移與粘附中發(fā)揮重要作用。研究證實，Hp可通過激活胃癌上皮細胞PI3K/Akt信號通路誘導EMT，促進胃癌的侵襲和轉移。但Hp感染正常胃粘膜細胞是否誘發(fā)EMT國內外未見明確報道。
　　目的：探討Hp感染正常胃粘膜是否通過PI3K/Akt信號通路誘導胃粘膜發(fā)生EMT，從而導致增值、凋亡紊亂參與疾病發(fā)生，闡

3、明Hp的致病機制，為Hp感染相關性疾病防治策略的制定提供新的理論和依據。
　　方法：①收集Hp陽性和陰性的慢性非萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生和胃癌病理標本（每組分別為39例、40例、39例和47例，其中再分為Hp陽性和陰性，共165例），行免疫組化檢測Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達。②ATCC43504 Hp標準菌株以MOI=50作用GES-1，同時以同

4、體積細胞培養(yǎng)液作用的GES-1作為對照組，0、0.5、1、3、6和12h后，行Western blot檢測Akt-GSK-3β-EMT信號通路相關蛋白的表達。③Akt抑制劑Akt InhibitorⅧ10μM預處理GES-11h，同時以同體積DMSO作用和未預處理的GES-1作為對照組，再以ATCC43504 Hp標準菌株MOI=50作用1h，行Western blot檢測Akt-GSK-3β-EMT信號通路相關蛋白的表達。④采用四唑藍

5、(MTT)比色試驗檢測細胞存活率。
　　結果：⑴Akt蛋白表達水平在各病變階段間無顯著性差異(p＞0.05);將所有標本按Hp陽性和陰性分兩組，Hp陽性組和陰性組各病變階段Akt蛋白表達亦呈現出類似結果(p＞0.05)。p-Akt蛋白表達水平在各病變階段間無顯著性差異(p＞0.05);將所有標本按Hp陽性和陰性分兩組，Hp陽性組各病變階段p-Akt蛋白表達亦呈現出類似結果(p＞0.05)，而Hp陰性組p-Akt蛋白表達水平隨胃黏膜

6、病變的演化而升高，在胃癌組達到最高(p＜0.05)。Akt蛋白表達在各病變階段Hp陽性和陰性組間均無顯著性差異(p＞0.05)。p-Akt蛋白表達在腸上皮化生、異型增生和胃癌階段Hp陽性和陰性組間亦無顯著性差異(p＞0.05)，而在慢性非萎縮性胃炎階段Hp陽性組p-Akt蛋白表達顯著高于Hp陰性組(p＜0.05)。⑵GSK-3β蛋白表達水平隨胃黏膜病變的演化而升高，但在胃癌組表達反而最低，各病變階段間表達有顯著性差異(p＜0.001);

7、將所有標本按Hp陽性和陰性分兩組，Hp陽性組和陰性組各病變階段GSK-3β蛋白表達亦呈現出類似結果(p＜0.001和p＜0.05)。p-GSK-3β蛋白表達水平在慢性非萎縮性胃炎組最低，后隨胃黏膜病變的演化而升高，在胃癌組表達最高(p＜0.05);將所有標本按Hp陽性和陰性分兩組，Hp陽性組各病變階段p-GSK-3β蛋白表達亦呈現出類似結果(p＜0.05)，而Hp陰性組各病變階段p-GSK-3β蛋白均有較高水平表達，各病變階段間表達無顯

8、著性差異(p＞0.05)。GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達在慢性非萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生階段Hp陽性和陰性組間亦無顯著性差異(p＞0.05)。但在胃癌階段，GSK3β蛋白表達在Hp陽性組顯著低于Hp陰性組(p＜0.05)，而p-GSK-3β蛋白表達在Hp陽性組顯著高于Hp陰性組(p＜0.05)。⑶E-cadherin蛋白表達水平隨胃黏膜病變的演化而降低，在胃癌組表達最低(p＜0.001);將所有標本按Hp陽性和陰性分兩組

9、，Hp陽性組和陰性組各病變階段E-cadherin蛋白表達亦呈現出類似結果(p＜0.001和p＜0.05)。N-cadherin蛋白表達水平在慢性非萎縮性胃炎組最低，后隨胃黏膜病變的演化而升高，在胃癌組表達最高，(p＜0.05);將所有標本按Hp陽性和陰性分兩組，Hp陽性組各病變階段N-cadherin蛋白表達亦呈現出類似結果(p＜0.05)，Hp陰性組在異型增生組及胃癌組均有較高水平表達(p＜0.05)。E-cadherin蛋白表達在

10、腸上皮化生和異型增生階段Hp陽性和陰性組間均無顯著性差異(p＞0.05)，而在慢性非萎縮性胃炎和胃癌階段Hp陽性組E-cadherin蛋白表達顯著低于Hp陰性組(p＜0.05)。N-cadherin蛋白表達在慢性非萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生階段Hp陽性和陰性組間亦無顯著性差異(p＞0.05)，而在胃癌階段Hp陽性組N-cadherin蛋白表達顯著高于Hp陰性組(p＜0.05)。⑷Hp活菌以MOI=50作用GES-1不同時間后，Ak

11、t、GSK3β表達水平均無明顯變化(p＞0.05)，而p-Akt表達水平在作用后0.5h即升高，3h達到高峰，12h內均高于0h(p＜0.001); p-GSK3β表達水平在作用后0.5h即增加，后逐漸升高，12h達到高峰(p＜0.01); E-Cadherin表達水平在作用后0.5h即減少，后逐漸降低，6h達到低谷，12h內均低于0h(p＜0.05); N-Cadherin表達水平在作用后0.5h即增加，后逐漸升高，3h達到高峰，12

12、h內均高于0h(p＜0.001)。而對照組Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、E-Cadherin、N-Cadherin蛋白表達水平均無明顯變化(p＞0.05)。⑸Akt InhibitorⅧ以10μm預處理GES-11h后，p-Akt(p＜0.001)、p-GSK-3β(p＜0.001)表達受抑，而Akt、GSK-3β、E-Cadherin、N-Cadherin表達無明顯變化(p＞0.05); DMSO預處理GES-1

13、1h后Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、E-Cadherin、N-Cadherin表達則均無明顯變化(p＞0.05)。⑹對照組、DMSO組、Akt iⅧ組中Hp作用亞組均以Hp活菌按MOI=50作用1h后，各組間Akt、GSK-3β表達均無明顯變化(p＞0.05)。對照組、DMSO組中Hp作用亞組p-Akt(p＜0.05、p＜0.01)、p-GSK-3β(p＜0.01、p＜0.05)、N-Cadherin(p＜0.05

14、、p＜0.05)表達水平均顯著高于各自組中的Hp未作用亞組，E-Cadherin(p＞0.05、p＞0.05)表達水平則均低于各自組中的Hip未作用亞組;而Akt iⅧ組中Hp作用亞組p-Akt、p-GSK-3β、N-Cadherin、E-Cadherin表達水平與各自組中的Hp未作用亞組均無明顯差異(p＞0.05)。⑺Hp活菌以不同濃度作用GES-1不同時間后MTT顯示，Hp活菌按MOI=5、10作用12h內，GES-1細胞存活率均無

15、明顯變化(p＞0.05);而按MOI=50、100作用6h后，GES-1細胞存活率均開始升高，12h達高峰(p＜0.001)，作用6、12h細胞存活率顯著高于0.5、1、3h(p＜0.001)，作用12h細胞存活率顯著高于6h(p＜0.001)。在Hp活菌作用GES-10.5、1、3h后，各濃度組與對照組間細胞存活率均無明顯差異(p＞0.05);而在作用6、12h后，MOI=50、100組細胞存活率均顯著高于對照組及MOI=5、10組(

16、p＜0.001)，MOI=100組細胞存活率顯著高于MOI=50組(p＜0.001)。⑻Hp活菌以MOI=50作用DSMO、Akt iⅧ預處理的GES-1不同時間后MTT顯示，在作用無預處理、DSMO預處理的GES-16h后，細胞存活率均開始升高，12h達高峰(p＜0.001)，作用6、12h細胞存活率顯著高于0.5、1、3h(p＜0.001)，作用12h細胞存活率顯著高于6h(p＜0.01);而在作用Akt iⅧ預處理的GES-112

17、h內，細胞存活率則無明顯變化(p＞0.05);在Hp活菌作用無預處理、DSMO預處理的GES-10.5、1、3h后，各組細胞存活率與各自對照組間均無明顯差異(p＞0.05)，作用6、12h后，各組細胞存活率均顯著高于各自對照組細胞存活率(p＜0.001);而Hp活茵作用Akt iⅧ預處理的GES-112h內，細胞存活率與對照組間則均無明顯差異(p＞0.05)。在Hp活菌作用無預處理、DSMO、Akt iⅧ預處理的GES-10.5、1、3

18、h后，各組間細胞存活率無明顯差異(p＞0.05);作用6、12h后，無預處理、DSMO預處理的GES-1細胞存活率均顯著高于Akt iⅧ預處理的GES-1細胞存活率(p＜0.001)，而無預處理、DSMO預處理的GES-1間細胞存活率無明顯差異(p＞0.05)。
　　結論：①體內研究結果說明:Akt-GSK-3β-EMT信號通路參與了Hp感染相關胃粘膜病變發(fā)生、發(fā)展，并且可能在胃粘膜早期病變階段啟動了EMT，促進胃癌的發(fā)生。②體外