低劑量放療誘導宮頸癌上皮-間質轉化分子機制的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 惡性腫瘤嚴重危害著人類的健康，其中宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率位居第二，死亡率位居第五。全世界每年約有50萬新發(fā)病例，其中約30萬的患者死于宮頸癌，在我國宮頸癌發(fā)病率居世界第二位，嚴重危害女性健康。目前，治療宮頸癌的方法主要有手術治療、放射治療和化學治療，根據(jù)2010 NCCN宮頸癌臨床實踐指南，放療是治療宮頸癌的重要手段之一，其適應癥廣泛，除嚴重的肝腎功能，造血功能障

2、礙外，Ⅰ～Ⅳ期患者均可進行放射治療，尤其對于晚期、復發(fā)或者無法手術的患者，放射治療是治療的重要方法。然而由于個體體質的差異以及腫瘤的異質性，不同患者對放射治療的反應不同，存在著放療敏感性和放療耐受性的差異，放療后達到治療效果也不一樣，放療耐受是宮頸癌治療失敗而出現(xiàn)復發(fā)轉移的重要原因之一。因此，闡明宮頸癌放療耐受性的機制將有望為設計宮頸癌的個體化治療提供理論基礎，也將為開發(fā)逆轉宮頸癌放療耐受的治療手段提供新的思路。
　　 在腫瘤微

3、環(huán)境中，許多因素影響腫瘤細胞對放射治療的反應。離子放射激活與細胞凋亡，DNA損傷修復，細胞粘附和血管新生信號通路相關的一系列基因，反過來，這些基因又調節(jié)細胞內的放療反應，影響放療效果。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞丟失細胞間的連接，獲得間質特性的過程。包括細胞上皮特異性連接蛋白E-cadherin的重新分布或丟失，間質marker N-cadherin和viment

4、in的發(fā)動，細胞的形態(tài)改變?yōu)楠M長的紡錘狀，遷移能力增強。EMT是上皮細胞在特定的生理和病理情況下轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，該過程也發(fā)生在腫瘤進展過程中。近年來上皮間質轉化在腫瘤中的作用逐漸被重視，研究報道EMT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉移等方面發(fā)揮著重要的作用。最近研究報道一些microRNA可以調控這一重要的生物學過程。
　　 MicroRNA(miRNA)是內源基因編碼的、長度約20-24個核菅酸的非編碼單鏈小RNA

5、分子。microRNA通過調節(jié)關鍵的靶基因mRNA，影響分化、增殖、代謝和凋亡多種細胞過程。miRNA在腫瘤里的圖譜和在正常組織的表達圖譜不同，這類圖譜可以作為疾病分類的新的方法。miRNA對EMT有很重要的調節(jié)作用，miRNA在細胞增殖、分化、凋亡、基因調控及疾病的發(fā)生中扮演重要的角色。miRNA-200c直接作用于轉錄抑制因子ZEB1及ZEB2的mRNA，上調腫瘤細胞系中E-cadherin的表達，從而減少EMT的發(fā)生。miR-20

6、0家族的成員(miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141，miR-429)和miR-205表達在發(fā)生EMT的MDCK細胞中顯著下調。microRNA的下調是EMT過程的一個必要成分，已經(jīng)證實TGFβ敏感的miR-200和ZEB之間通過雙向負反饋環(huán)(double-negative feedbackloop)影響EMT。EMT在肺癌中影響miRNA的表達，并且通過EMT調節(jié)肺癌細胞的侵襲和轉移。因而闡明調控腫瘤細胞

7、發(fā)生EMT過程的分子機制，明確其在惡性腫瘤的發(fā)生、進展中的作用，并探索基于EMT的診斷方法具有重要的臨床意義。
　　 NF-κ B是在調節(jié)細胞凋亡和腫瘤發(fā)生中起重要作用的轉錄因子，而且是在誘導EMT和維持EMT中是必不可少的。NF-κ B信號的強度和持續(xù)時間由多個負反饋機制控制，從而使NF-κ B信號在癌細胞中保持其致癌性。microRNA對NF-κB有調節(jié)作用來調控NF-κ B調節(jié)的基因表達，影響這些基因的功能。在神經(jīng)膠質瘤m

8、iR-182過表達，直接抑制CYLD（腫瘤抑制基因）（NF-κB的負性調節(jié)子）的表達，促進泛素結合NF-κ B信號通路成分誘導膠質細胞表現(xiàn)侵襲性表型。并且TGF-β誘導的miR-182表達可以延長NF-κ B的活化時間。miR-146a在大部分胃癌表達上調，抑制GPCR（G蛋白偶聯(lián)受體）介導的NF-κB的激活，因而減少NF-κB調節(jié)的腫瘤促進激酶的表達和生長因子的表達。通過作用于NF-κB活化通路的一些成分，miR-146a在調節(jié)NF-

9、κB活性中起關鍵作用。miRNA與p53，NF-κ B，β-catenin通路相互作用在調節(jié)EMT和保持腫瘤干細胞中起重要作用。乳腺癌中抑制miR-448通過直接作用于特異的AT-富集序列結合蛋白-1(SATB1)的mRNA，導致雙調蛋白水平升高，表皮生長因子(EGFR)受體介導的Twist1表達升高，NF-κB激活，從而可以誘導EMT?；谶@些報道，我們猜想miRNA調節(jié)NF-κ B在宮頸癌放療耐受相關EMT中起作用。
　　

10、本研究旨在闡明宮頸癌放療耐受的機制，為設計宮頸癌的個體化治療提供理論基礎。本課題進行了三部分的研究:(1)建立宮頸癌放療耐受細胞株;(2)宮頸癌放療耐受細胞株EMT的發(fā)生及機制研究;(3)宮頸癌放療耐受相關miRNA的篩選及功能分析。
　　 方法:
　　 根據(jù)文獻報道及2010 NCCN宮頸癌臨床實踐指南自行建立放療耐受(FIR)的細胞模型進行實驗研究。采用低劑量持續(xù)分級放療的方法，給予2Gy/day的劑量照射宮頸癌細胞

11、株SiHa，C-33 A，5 days/week，至總劑量達到75Gy，細胞休息2周后實驗。進行克隆形成實驗、細胞周期及凋亡的檢測驗證FIR細胞是否對放療耐受。
　　 在建立FIR細胞進行放療的過程中，進行形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)與親本細胞相比，F(xiàn)IR細胞株發(fā)生了顯著的形態(tài)學改變，此改變符合EMT。為了證實FIR細胞株是否真F發(fā)生了EMT，我們進行western blot實驗檢測了EMT的標志蛋白E-cadherin和N-cadheri

12、n的變化。確定FIR細胞株發(fā)生EMT后，進行定量PCR實驗在mRNA水平，western blot實驗在蛋白水平檢測FIR細胞與親本細胞(N細胞)其他EMT marker的變化，并進行分子機制研究。使用siRNA干擾FIR細胞中NF-κ B p65表達后，檢測EMT marker表達，研究NF-κ B p65是否參與調控低劑量放療誘導的宮頸癌EMT。
　　 miRNA表達譜芯片是研究miRNA的有力工具，通過對宮頸癌放療耐受細胞

13、株與親本細胞的miRNA表達譜的分析，篩選出放療耐受相關的miRNA，為今后開發(fā)逆轉宮頸癌患者放療耐受的新治療手段提供新的靶標。我們使用microRNA芯片檢測宮頸癌N細胞及FIR細胞，篩選與放療耐受相關的microRNA。合成miRNA的引物，定量PCR驗證芯片數(shù)據(jù)結果，并對顯著差異的miRNA進行功能研究，篩選放療耐受相關miRNA。合成FIR細胞表達降低的miRNA的模擬物mimicmiRNA，導入FIR細胞后，定量PCR和wes

14、tern blot檢測EMT marker表達變化。同時western blot檢測宮頸癌FIR細胞表達NF-κ B p65的變化;siRNA干擾FIR細胞表達的NF-κ B p65后定量PCR實驗檢測miRNA表達的變化。
　　 結果:
　　 克隆形成實驗顯示親本細胞和FIR細胞接受2Gy的X-ray照射后，F(xiàn)IR細胞克隆形成的能力比親本細胞增強;FIR細胞倍增的時間比親本細胞長;接受不同劑量的X-ray照射后，F(xiàn)IR

15、細胞凋亡率低于親本細胞，說明FIR細胞耐受放療。這些結果表明宮頸癌FIR細胞具有宮頸癌放療耐受的特點，宮頸癌放療耐受細胞系建立成功。
　　 在建立宮頸癌FIR細胞，對宮頸癌N細胞進行放療的過程中，通過形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)與親本細胞相比，F(xiàn)IR細胞株發(fā)生了顯著的形態(tài)學改變，細胞由鋪路石樣的上皮表型變成細長的間質表型，此改變符合上皮-間質轉化，同時細胞遷移和侵襲的能力增強。
　　 為了證實FIR細胞株是否真正發(fā)生了EMT，我們進

16、行western blot檢測了EMT的標志蛋白E-cadherin和N-cadherin的變化，結果顯示FIR細胞表達的E-cadherin降低，N-cadherin表達升高，從而初步證實了FIR細胞有EMT的改變。進一步進行定量PCR實驗在mRNA水平，western blot實驗在蛋白水平檢測FIR細胞與親本細胞其他EMT marker的變化，發(fā)現(xiàn)上皮性marker CK-18表達降低，間質marker vimentin表達升高。

17、使用siRNA干擾FIR細胞中p65表達后，E-cadherin表達升高，N-cadherin表達降低，說明NF-κ B p65參與調控低劑量分級放療誘導的宮頸癌放療耐受相關EMT。
　　 microRNA芯片檢測宮頸癌親本細胞及FIR細胞，篩選與放療耐受相關的miRNA。結果顯示，在1198個microRNA探針中有20個microRNA有差異，定量PCR驗證了芯片數(shù)據(jù)結果。合成FIR細胞表達降低的miRNA的模擬物mimic

18、miRNA，導入FIR細胞后，定量PCR和western blot檢測EMT marker表達變化，其中導入mimic miR-1236后FIR細胞表達的E-cadherin升高和N-cadherin表達降低，差異有顯著性，說明miR-1236參與調節(jié)低劑量分級放療引起的宮頸癌放療耐受相關EMT。
　　 進一步研究發(fā)現(xiàn)FIR細胞導入miR-1236后NF-κ B p65的表達降低，同時使用siRNA干擾NF-κ B p65后FI

19、R細胞表達的miR-1236比對照組顯著升高，說明miR-1236和NF-κ B p65相互調節(jié)在低劑量分級放療誘導的宮頸癌EMT導致的放療耐受中起調控作用。
　　 結論:
　　 1.低劑量分級持續(xù)放療可以誘導宮頸癌細胞發(fā)生上皮-間質轉化而發(fā)生放療耐受。
　　 2.NF-κ B p65參與調控宮頸癌放療耐受相關的EMT。
　　 3.miR-1236參與調控宮頸癌放療耐受相關的EMT。
　　 4.m