2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
   宮頸癌(cervicalcancer,CC)是女性常見的惡性腫瘤,位居女性生殖器官惡性腫瘤的首位,是全球最主要的癌癥之一。目前研究認為人乳頭瘤病毒(humanpapilomavirus,HPV)感染特別是高危型別的持續(xù)性感染,是引起子宮頸癌前病變和宮頸癌的基本原因。
   HPV為乳頭多瘤空泡病毒科的A亞群,是一類具有高度宿主特異性和親和力、無包膜的、小的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,由核心和蛋白衣殼(L1和L2)組

2、成。其基因組中含有8個開放閱讀框架和1個上游調(diào)節(jié)區(qū),其中E2、E6和E7三個開放閱讀框架為病毒癌基因。目前已發(fā)現(xiàn)120余種HPV亞型,分子流行病學發(fā)現(xiàn)超過2/3的宮頸癌標本被檢測出HPV16或18陽性。其DNA可以隨機整合到宿主基因組并表達E6、E7癌基因并使宿主細胞永生化,E6、E7基因可以分別表達E6、E7蛋白,其蛋白可以分別和抑癌蛋白p53和視網(wǎng)膜母細胞瘤抑制蛋白(Retinoblastomatumorsuppressorprot

3、ain,pRB)結(jié)合,阻遏其抑癌功能,進而促進癌癥的發(fā)生發(fā)展。
   上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是指在某些生理或病理狀態(tài)下,上皮細胞失去極性,轉(zhuǎn)換成具有活動能力、能夠在細胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細胞的過程。它在胚胎形成和組織的形態(tài)發(fā)生過程中是一個基本的生理過程,特別是中胚層、神經(jīng)脊、鄂等的發(fā)育。但近來的研究發(fā)現(xiàn)EMT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切的相關(guān)性。目前大

4、量的研究關(guān)注于EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。在誘導EMT發(fā)生的眾多細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子中,轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)被證實是誘導EMT的關(guān)鍵因子。
   目前已有大量有關(guān)TGF-β參與腫瘤EMT的報道,在宮頸癌中是否也存在這種現(xiàn)象,其與HPV在導致宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)系如何,仍有待研究。
   方法:
   ①體外培養(yǎng)HPV16陽性的鱗癌(SiHa)和HP

5、V18陽性的腺癌(HeLa)細胞系,分別設(shè)計針對HPV16E7的MiRNA干擾載體12MR0018C-1、12MR0018C-2、12MR0018C-3和12MR0018C-4(簡稱16E7-MiR-1、16E7-MiR-2、16E7-MiR-3和16E7-MiR-4)和針對HPV18E7的MiRNA干擾載12MR0018D-1、12MR0018D-2、12MR0018D-3和12MR0018D-4(簡稱18E7-MiR-1、18E7-

6、MiR-2、18E7-MiR-3和18E7-MiR-4),采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染針對HPV16和HPV18E7基因的質(zhì)粒,Real-timePCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后E7基因的表達差異以沉默效率較高的質(zhì)粒進行后續(xù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;
   ②將前期課題組使用的針對HPV16E6和HPV18E6的stealthRNA轉(zhuǎn)換成MiRNA,并構(gòu)建到pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR載體中,構(gòu)建成分別針對HPV16E6和HPV18E

7、6的質(zhì)粒12MR0018A和12MR0018B(簡稱16E6-MiR、18E6-MiR);
   ③構(gòu)建分別沉默HPV16和HPV18病毒E6、E7基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系;
   ④Real-TimePCR方法分別檢測轉(zhuǎn)染前后EMT的標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)和β-連環(huán)素(β-catenin)的表達差異;Real-timePCR方法分別檢測轉(zhuǎn)染前后TGF-β1、TGF-

8、βRⅡ(TβRⅡ)和Smad4基因水平的變化。
   結(jié)果:
   1.成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒,在SiHa細胞系中,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒16E6-MiR后HPV16E6基因的表達明顯下降,Real-TimePCR結(jié)果顯示有效抑制率為77%(P=0);轉(zhuǎn)染質(zhì)粒16E7-MiR-1、16E7-MiR-2、16E7-MiR-3和16E7-MiR-4后,質(zhì)粒16E7-MiR-2和16E7-MiR-4可以有效抑制HPV16E7基因的表達,Re

9、al-TimePCR結(jié)果顯示有效抑制率分別達到66%(P=0)和51%(P=0.003),而質(zhì)粒16E7-MiR-1和16E7-MiR-3則無明顯抑制效果。
   2.在HeLa細胞系中,采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染18E6-MiR質(zhì)粒,Real-TimePCR檢測HPV18E6基因的表達明顯下降,與未轉(zhuǎn)染Hela組相比下降約87%(P=0);轉(zhuǎn)染質(zhì)粒18E7-MiR-1、18E7-MiR-2、18E7-MiR-3和D18E7

10、-MiR-4后,18E7-MiR-1和18E7-MiR-4組HPV18E7基因的表達明顯下降,分別下降約68%(P=0)和55%(P=0),而18E7-MiR-2和18E7-MiR-3則無明顯抑制效果。
   3.在SiHa組中,以質(zhì)粒16E6-MiR和沉默效率較高的質(zhì)粒16E7-MiR-2構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,進行后續(xù)試驗。Real-TimePCR結(jié)果示HPV16E6、E7基因表達被抑制后,EMT的標志物E-cadherin表達

11、明顯升高(P<0.05),而N-cadherin和β-catenin則明顯下降(P<0.05)。
   當HPV16E6、E7基因表達明顯被抑制后,Real-TimePCR示TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達水平均明顯下降(P<0.05)
   4.在HeLa組中,以質(zhì)粒18E6-MiR和沉默效率較高的質(zhì)粒18E7-MiR-1所構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系進行后續(xù)實驗。Real-TimePCR結(jié)果示HPV18E6和E

12、7基因表達被明顯抑制后,EMT的標志物E-cadherin表達明顯升高(P<0.05),而N-cadherin和β-catenin則表達下降(P<0.05)。
   當HPV18E6、E7基因表達明顯被抑制后,Real-TimePCR示TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達均下降(P<0.05)。
   結(jié)論:
   1.在宮頸癌細胞中,HPV病毒的E6、E7基因可促進上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化;當E6、E7基因被

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