烏鱧水泡病毒感染SSN-1細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制研究.pdf

1、彈狀病毒是一類(lèi)具有包膜、單鏈、負(fù)義的RNA病毒，病毒結(jié)構(gòu)多數(shù)呈子彈狀，有時(shí)也會(huì)呈現(xiàn)桿狀或棒狀。病毒的核衣殼由病毒基因組RNA、核蛋白(Nucleoprotein，N)、RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，L)及磷酸化蛋白(Phosphoprotein,P)組成?；|(zhì)蛋白(Matrix protein，M)包裹在核衣殼外表面，病毒粒子表面覆蓋有糖蛋白(Glycoprotein，G)形成的釘狀

2、突起。彈狀病毒科成員眾多，目前已經(jīng)明確報(bào)道的約為185種，其宿主范圍極為廣泛，能夠感染哺乳類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)及植物等，并且導(dǎo)致所感染宿主患病或死亡，是重要的病原類(lèi)群。已經(jīng)報(bào)道的魚(yú)類(lèi)彈狀病毒有20多種，嚴(yán)重影響魚(yú)類(lèi)的健康養(yǎng)殖，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。烏鱧水泡病毒(snakehead fish vesiculovirus，SHVV)是從患病雜交鱧上分離到的一株彈狀病毒，對(duì)烏鱧的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的危害。至今，還沒(méi)有高效防控該病毒的措施。研

3、究病毒的致病機(jī)理及宿主對(duì)病毒的防御機(jī)制，對(duì)病毒的防控具有重要意義。
　　自噬是真核細(xì)胞利用囊泡結(jié)構(gòu)將細(xì)胞內(nèi)需要降解的大分子物質(zhì)或是損傷的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到溶酶體進(jìn)行降解的過(guò)程，旨在維持細(xì)胞處于穩(wěn)定的狀態(tài)。細(xì)胞自噬在病原微生物入侵宿主過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用，病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可以破壞病毒結(jié)構(gòu)蛋白形成過(guò)程，或者將病毒粒子轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解，進(jìn)一步抑制病毒復(fù)制。而一些病毒反而可以利用細(xì)胞自噬逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用，從而利于自身的增殖。本

4、研究主要圍繞SHVV感染與細(xì)胞自噬間的相互關(guān)系及相關(guān)機(jī)制展開(kāi)，主要結(jié)果如下:
　　1.微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β(Microtubule-associated protein1 light chain3-beta, LC3B)基因的克隆、生物信息學(xué)分析及抗體制備。
　　LC3B是細(xì)胞自噬的重要標(biāo)記蛋白。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的SHVV感染條紋月鱧細(xì)胞系(SSN-1)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們克隆了烏鱧LC3B基因開(kāi)放讀碼框，長(zhǎng)度為378 bp

5、，編碼125個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)出理論分子量是14.8 kDa，理論等電點(diǎn)是5.23。與其他9個(gè)物種進(jìn)行了同源性分析，發(fā)現(xiàn)烏鱧LC3B基因與草魚(yú)和大西洋鯡的LC3B基因相似度最高，達(dá)到93％。我們構(gòu)建了pET-32a-LC3B重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)、純化該融合蛋白，隨后使用純化蛋白對(duì)兔進(jìn)行免疫，獲得抗烏鱧LC3B多克隆抗體。
　　2.SHVV病毒粒子結(jié)構(gòu)的電鏡觀察。
　　收集SHVV感染SSN-1細(xì)胞24 h后的樣品，經(jīng)過(guò)常規(guī)透射電鏡

6、樣品處理，在透射電子顯微鏡下觀察，我們觀察到子彈狀的病毒粒子，分布在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外，大小約為70×120 nm。
　　3.SHVV感染誘導(dǎo)SSN-1細(xì)胞自噬。
　　細(xì)胞自噬研究方法主要分為透射電子顯微鏡觀察、激光共聚焦顯微鏡觀察及免疫印跡等方法。我們利用以上三種方法依次證明SHVV感染SSN-1后可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬產(chǎn)生。在透射電子顯微鏡下，觀察到典型的囊泡狀結(jié)構(gòu);熒光顯微鏡下觀察到明顯的YFP-SSN-LC3B熒光點(diǎn)聚集現(xiàn)象;

7、通過(guò)western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ轉(zhuǎn)化明顯增強(qiáng)。
　　4.細(xì)胞自噬抑制SHVV增殖。
　　細(xì)胞自噬常用激活劑和抑制劑分別為rapamycin和3-MA。首先用藥物孵育SSN-1細(xì)胞，隨后使用SHVV感染處理過(guò)的SSN-1細(xì)胞，研究自噬對(duì)病毒增殖的影響。分別檢測(cè)SHVV-N基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并且檢測(cè)培養(yǎng)基中成熟病毒粒子titer(TCID50)。結(jié)果表明細(xì)胞自噬抑制SHVV的增殖。