三氯生對(duì)母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞在胚胎植入和胎盤發(fā)育的過程中起著至關(guān)重要的作用，胚胎植入時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞粘附并侵入母體子宮內(nèi)膜，最終形成胎盤。胚胎植入后，滋養(yǎng)細(xì)胞利用侵襲完成對(duì)子宮螺旋動(dòng)脈的重塑，為胎兒與母體之間的物質(zhì)交換與氧氣運(yùn)輸提供基礎(chǔ)，保障胎兒正常發(fā)育。一旦滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力下降，就可能導(dǎo)致胚胎著床失敗、先兆子癇（pre-eclampsia）、自發(fā)流產(chǎn)(spontaneous abortion)以及胚胎發(fā)育受損。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲主要受到細(xì)胞因子、趨化因子、整

2、合素(integrin)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的調(diào)控。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶能夠降解滋養(yǎng)細(xì)胞外基質(zhì)的絕大多數(shù)成分，為滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲掃清障礙。
　　另一方面，母胎界面的免疫耐受能使胎兒免受母體的免疫排斥，其中蛻膜免疫細(xì)胞在維持免疫耐受的過程中起著重要的作用。巨噬細(xì)胞在母胎界面中主要極化為M2型巨噬細(xì)胞，分泌高水平的抑制性細(xì)胞因子IL-10，低表達(dá)前炎性細(xì)胞因子IL-1β，有利

3、于維持免疫耐受及妊娠。
　　大量證據(jù)顯示，三氯生(triclosan，TCS)可能與妊娠早期胚胎植入失敗、妊娠中后期胚胎發(fā)育不良以及流產(chǎn)相關(guān)。TCS是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Environmental Endocrine Disruptors，EEDs），在日常生活中廣泛存在。由于具有廣譜抗菌的作用，TCS經(jīng)常被添加于牙膏、肥皂以及洗發(fā)水等日常生活用品中。TCS的結(jié)構(gòu)與雌激素非常類似，它能夠模擬雌激素結(jié)合雌激素受體(estrogen

4、 receptor，ER)進(jìn)入細(xì)胞，并通過影響母體雌激素和甲狀腺激素的表達(dá)和分泌來影響胎兒的發(fā)育。不過，三氯生影響胚胎植入以及自發(fā)流產(chǎn)的相關(guān)分子機(jī)制目前尚不清楚。
　　目的:
　　研究TCS對(duì)母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響及其相關(guān)分子機(jī)制;研究TCS對(duì)妊娠中期蛻膜巨噬細(xì)胞極化的影響，為EEDs導(dǎo)致的病理性妊娠的預(yù)防和治療提供新的策略和思路。
　　方法:
　　1.總體設(shè)計(jì):
　　為了研究TCS對(duì)胚胎植入期的影響，

5、我們首先建立TCS誘導(dǎo)的小鼠植入期流產(chǎn)模型，觀察TCS對(duì)于小鼠胚胎植入的影響。然后通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察TCS是否能在體外影響人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo的侵襲;通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察TCS能否影響HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移。接下來，我們在體內(nèi)體外分別檢測在TCS的刺激下，調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)是否受到影響。在體外檢測信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平，推測TCS通過哪條信號(hào)通路影響MMPs

6、的表達(dá)進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲;使用SOCS3 siRNA沉默SOCS3基因的表達(dá)，激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，再通過侵襲實(shí)驗(yàn)確認(rèn)TCS是否仍能影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，并檢測MMPs的表達(dá)，從而確認(rèn)TCS是否通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活下調(diào)MMPs的表達(dá)進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲。
　　此外，為了研究TCS對(duì)妊娠中期的影響，我們首先建立了TCS誘導(dǎo)的小鼠妊娠中期胚胎流產(chǎn)模型，觀察TCS對(duì)于胚胎中期孕鼠自發(fā)流產(chǎn)率的影響;并

7、從孕鼠子宮中分離蛻膜組織，在mRNA水平上檢測蛻膜組織中M1型和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)。
　　2.TCS對(duì)孕鼠胚胎植入的影響
　　將6-8周性成熟的ICR雌鼠與雄鼠合籠，分別于每天早晨8:00及晚上8:00檢查雌鼠陰道栓，檢栓陽性記為孕0.5天，將孕鼠隨機(jī)設(shè)置DMSO對(duì)照和TCS處理組，連續(xù)灌胃至孕4.5天。在孕5.5天時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)孕鼠進(jìn)行尾靜脈注射，之后頸椎脫臼處死，取小鼠子宮，統(tǒng)計(jì)小鼠的胚胎植入數(shù)。
　　3.

8、TCS對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響
　　將HTR-8/SVneo細(xì)胞懸液加入鋪有基質(zhì)膠的小室中，置于24孔板內(nèi)，每孔加適量完全培養(yǎng)基。TCS處理24小時(shí)后，結(jié)晶紫染色，用正置顯微鏡觀察小室中侵襲的滋養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　4.TCS對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的影響
　　通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證TCS是否能夠抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移。
　　5.TCS對(duì)子宮基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響
　　從孕鼠體內(nèi)分離得到子宮，提取其組織

9、蛋白，使用蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting，WB)方法檢測母胎界面基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)。
　　6.TCS對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶等調(diào)控分子表達(dá)的影響
　　使用Western blotting檢測TCS處理后HTR-8/SVneo細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、粘附分子CD146和整合素integrinβ1的表達(dá)情況。
　　7.TCS對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞部分信號(hào)通路的影響
　　使用

10、Western blotting分別檢測TCS處理HTR-8/SVneo后ERK1/2、AKT和JAK2/STAT3的磷酸化情況;并檢測JAK2/STAT3通路的抑制蛋白SOCS3的表達(dá)情況。分別用ERK1/2和AKT的抑制劑與TCS同時(shí)處理HTR-8/SVneo，Western blotting檢測MMP-2的表達(dá);將SOCS3 siRNA轉(zhuǎn)染入HTR-8/SVneo細(xì)胞，Western blotting檢測SOCS3、p-STAT3

11、以及MMP-2的表達(dá)，侵襲實(shí)驗(yàn)檢測TCS對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響。
　　8.TCS對(duì)妊娠中期孕鼠流產(chǎn)率的影響
　　將6-8周性成熟的ICR雌鼠與雄鼠合籠，分別于每天早晨8:00及晚上8:00檢查雌鼠陰道栓，檢栓陽性記為孕0.5天，隨機(jī)設(shè)置DMSO對(duì)照和TCS處理組，連續(xù)灌胃至孕14.5天。在孕15.5天時(shí)將孕鼠頸椎脫臼處死，取小鼠子宮，統(tǒng)計(jì)小鼠的胚胎流產(chǎn)率。
　　9.TCS對(duì)妊娠中期巨噬細(xì)胞極化的影響
　　Q-PCR

12、檢測孕15.5天孕鼠蛻膜組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、CD206、IL-10以及Ym1 mRNA水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　TCS能夠顯著降低孕鼠的胚胎著床率，并下調(diào)子宮基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)證明，TCS能夠顯著影響滋養(yǎng)細(xì)胞的自發(fā)侵襲;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明，TCS能夠顯著影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移。在體外，TCS也能夠顯著提高M(jìn)MP-2的組織抑制劑TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)，降低滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2

13、的表達(dá)。TCS能夠顯著激活滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ERK和AKT的磷酸化，同時(shí)通過促進(jìn)SOCS3的表達(dá)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活。使用SOCS3 siRNA沉默滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)SOCS3的表達(dá)，可以恢復(fù)TCS對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的抑制，同時(shí)也恢復(fù)了MMP-2的表達(dá)。在妊娠中期TCS能夠顯著提高孕鼠胚胎流產(chǎn)率，并提高M(jìn)1型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，降低M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子CD206的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　在胚