銅綠假單胞菌對微生物的抑制作用及機理探討.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 銅綠假單胞菌藥物敏感性試驗及流行病學分析
　　目的：
　　了解同濟醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌基因型及耐藥情況，為抗生素的合理使用及感染控制提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　收集同濟醫(yī)院2012年6月-2012年8月從臨床感染患者標本中分離鑒定得到的60株銅綠假單胞菌，采用Kirby-bauer法對60株銅綠假單胞菌的耐性情況進行分析；用多位點序列分型技術（Mul

2、tillocus sequence typing,MLST），以銅綠假單胞菌7個管家基因acsA、aroE、guaA mutL、nuoD、ppsA和trpE的內(nèi)部特定核酸片段作為檢測的靶基因，對60株銅綠假單胞菌的靶基因進行PCR擴增和測序，測序結(jié)果在Pseudomonas aeruginosa MLST數(shù)據(jù)庫中進行比對，最終確定這60株銅綠假單胞菌的基因型；通過eBURST方法對這60株銅綠假單胞菌進行進化聚類分析，同時通過Split

3、sTree軟件進行菌株基因遺傳進化分析。并使用SPSS統(tǒng)計軟件分析差異顯著性。
　　結(jié)果：
　　60株銅綠假單胞菌對多種抗菌藥物耐藥率均較高，耐藥率由高到低依次是：米諾環(huán)素(MH)（100.0％）、哌拉西林(PIP)(55.0％)、左氧氟沙星(LEV)(51.6％)、亞胺培南(IPM)(48.3％)、慶大霉素(GN)(48.3％)、頭孢哌酮(CFP)(48.3％)、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)(46.6％)、美洛培南(MEM)

4、(46.6％)、環(huán)丙沙星(CIP)(45.0％)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)(45.0％)、頭孢吡肟(FEP)(43.3％)、氨曲南(ATM)(43.3％)、阿米卡星(AK)(38.3％)和頭孢他啶(CAZ)(15.0％)。其中9株對所測試的14種抗生素全部耐藥。MLST分析顯示60株銅綠假單胞菌可分為11個ST型，即ST262、ST195、ST767、ST274、ST527、ST849、ST639、ST871、ST244、ST636

5、和ST645型，未發(fā)現(xiàn)新的型別；其中ST244和ST274是優(yōu)勢ST型別，分別占26.67％(16/60),18.33％(11/60)；且ST244型在ICU及呼內(nèi)科數(shù)量顯著高于其它科室（p<0.05）。ST244、ST274型在碳青霉烯類藥物不敏感組中所占比例要顯著高于在碳青霉烯類藥物敏感組中所占比例（p<0.05）,其它ST型與藥物敏感性試驗無相關性（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　60株銅綠假單胞菌耐藥性較為嚴重，并

6、出現(xiàn)9株全耐株。本地區(qū)以ST244和ST274為優(yōu)勢克隆株，尤其在ICU及呼內(nèi)科數(shù)量顯著高于其它科室，提示醫(yī)院內(nèi)存在小范圍的傳播。ST244和ST274型與耐藥性的關系尚不能確定，需作進一步研究。
　　第二部分 銅綠假單胞菌對其它微生物的抑制作用觀察
　　目的：
　　觀察臨床分離的銅綠假單胞菌對微生物的抑制作用，為抗感染治療藥物研發(fā)提供線索。
　　方法：
　　采用紙片法觀察臨床分離銅綠假單胞菌對金黃色葡萄球

7、菌ATCC25923及對白色念珠菌ATCC90028的抑制作用，在抑菌作用最強和無抑菌作用的銅綠假單胞菌中各選擇2株菌(PA1206、PA1246和PA1201、PA1222)用于進一步研究。通過紙片法、十字征劃痕實驗和共孵育實驗檢測這4株銅綠假單胞菌對革蘭陽性球菌（包括MRSA,VISA及MRSA）、革蘭陽性桿菌、革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏陰性球菌及真菌的抑制作用；觀察溫度、pH值、孵育時間、碳源及氮源對銅綠假單胞菌抑菌作用的影響。建立小

8、鼠共感染模型觀察銅綠假單胞菌對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌的體內(nèi)抑制作用。
　　結(jié)果：
　　PA1206和PA1246對革蘭陽性球菌(包括MRSA,VISA及MRSA)、革蘭陽性桿菌、革蘭陰性雙球菌、真菌具有顯著抑制作用,抑制率為100％，對革蘭陰性桿菌則無抑制作用，PA1201和PA1222對上述指示菌均無作用。在影響因素中，銅綠假單胞菌孵育后24小時后培養(yǎng)物在4℃到121℃之間時顯示對金黃色葡萄球菌ATCC25923抑制作

9、用沒有明顯改變。pH值為7時抑制作用最強，而pH=4,pH=10時，抑制作用喪失。在麥芽糖(maltose)和可溶性淀粉(starch soluble)作碳源時，抑制作用相對減弱,使用其它碳源時抑制作用較強。在使用氮源時， L-天冬酰胺(asparaginate),磷酸銨(ammonium phosphate)能完全抑制銅綠假單胞菌的活性成分的產(chǎn)生，使它對金黃色葡萄球菌ATCC25923的抑制作用完全喪失。硝酸胺(ammonium ni

10、trate),硝酸鈉(sodium nitrate)則能部分的抑制銅綠假單胞菌對金黃色葡萄球菌ATCC25923的抑制作用。硝酸鉀(Potassium nitrate),硫酸銨(ammonium sulfate),氯化銨(ammonium chloride)作為氮源時銅綠假單胞菌的抑菌作用最強。孵育時間顯示，第1天到第12天殺滅作用逐漸增強，第12天至第15天抑制作用逐漸減弱。銅綠假單胞菌與白色念珠菌（或金黃色葡萄球菌）共感染模型顯示，

11、在小鼠體內(nèi)對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌也具有抑制作用。
　　結(jié)論：
　　銅綠假單胞菌對革蘭陽性球菌，革蘭陽性桿菌，革蘭陰性球菌及真菌有殺滅或抑制作用，而對革蘭陰性桿菌則幾乎沒有作用。pH值、碳源及氮源、孵育時間的改變可影響其抑制作用。銅綠假單胞菌在體內(nèi)對其它微生物也具有抑制作用。對臨床上比較棘手的MRSA、VISA、MRSCN及真菌感染可能提供新的治療途徑。
　　第三部分 銅綠假單胞菌對微生物抑制作用機制研究
　

12、　目的：
　　探討銅綠假單胞菌對其它微生物抑制作用的機制，以期發(fā)現(xiàn)針對微生物感染的治療方法。
　　方法：
　　脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析這四株銅綠假單胞菌的同源性。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析這4株菌在分泌蛋白上的差異。通過對4株菌的培養(yǎng)物進行氯仿粗提后，運用薄層液相色譜(TLC)，放射自顯影分析其活性成分組分，分析型高效液相色譜對粗提物進行分析，硅膠柱對粗提物進行初步分純，再通過制備型高效液相對初步分純物各

13、主峰洗脫液進行收集純化，得到有效主峰洗脫液成分，純化后進行抑菌實驗，并通過質(zhì)譜分析其分子量大小。
　　結(jié)果：
　　PFGE顯示這四株菌來源各不相同。SDS-PAGE顯示有抑制作用的PA1206和PA1246在分泌蛋白上與無抑制作用的PA1201和PA1222存在明顯差異。氯仿粗提物顯示，PA1201和PA1222顏色呈綠色，PA1206和PA1246呈深棕色。銅綠假單胞菌PA1206和PA1246粗提物顯示有抑制作用，而PA

14、1201和PA1222粗提物則沒有作用。粗提物經(jīng)硅膠柱層析分離初步純化及制備型高效液相進一步分離純化后，采用質(zhì)譜分析確認PA1206和PA1246主要活性成分為4種小分子類物質(zhì)。這可能是與PA1201和PA1222產(chǎn)生不同作用的主要機制。
　　結(jié)論：
　　有抑制和殺滅作用的銅綠假單胞菌是通過產(chǎn)生特異分泌性蛋白，或小分子物質(zhì)來抑制其它微生物，沒有作用的銅綠假單胞菌則不產(chǎn)生這些小分子物質(zhì)或蛋白。此二株有很強活性的菌株代謝產(chǎn)物有可