表達MAGE-A3的瘧原蟲減毒子孢子的構建及誘導抗肺癌免疫的機制研究.pdf

1、肺癌是當前世界上的最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡人數(shù)在我國位于所有腫瘤首位。盡管外科手術、化療、放療、分子靶向藥物治療等治療方式的不斷發(fā)展，但中晚期肺癌的療效并不理想，預后較差。近年來興起的免疫療法則主要通過增強機體的免疫應答達到抗腫瘤作用，具有敏感性高、特異性強的特點，被認為是最有希望的中晚期肺癌治療策略。
　　腫瘤疫苗不但能預防腫瘤的發(fā)生，而且還可以用于腫瘤的治療，是重要的腫瘤免疫治療策略之一。大量的研究證實，CD4/CD

2、8+T細胞免疫應答是機體的免疫系統(tǒng)監(jiān)視和抑制腫瘤的最主要效應機制，因此是設計有效腫瘤疫苗的重要依據(jù)。然而目前并無較理想的腫瘤疫苗。究其原因，可能與機體的免疫耐受抑制腫瘤疫苗誘導強烈的CD4/CD8+T細胞免疫應答有關。因此，尋找能夠有效誘導機體CD4/CD8+T應答的腫瘤疫苗載體是目前研究的焦點。
　　鑒于瘧原蟲遺傳減毒子孢子(GAS)可以克服機體免疫耐受，并高效誘導瘧原蟲特異性CD8+/CD4+T細胞反應，本項目以遺傳減毒子孢子

3、作為載體，構建表達主要肺癌相關抗原MAGE-A3的重組遺傳減毒子孢子疫苗，觀察能否活化MAGE-A3特異性CD4/CD8+T細胞，以達到抗肺癌的作用，并進一步探討相關機制，這可為設計有效的肺癌等腫瘤疫苗提供新思路。
　　一、利用CRISPR/Cas9技術構建穩(wěn)定表達MAGE-A3的瘧原蟲減毒子孢子
　　為了探討表達肺癌相關抗原MAGE-A3的重組遺傳減毒子孢子是否具有抗肺癌的作用，本研究擬利用CRIPSR-cas9技術對伯氏

4、瘧原蟲ANKA株(P.b ANKA)子孢子UIS3基因序列替換成肺癌相關抗原MAGE-A3，從而獲得能夠成功入侵肝細胞但不能在體內繼續(xù)增殖發(fā)育，而且能夠表達MAGE-A3的重組遺傳減毒子孢子（GAS/MAGE-A3）。按照廈門大學袁晶教授的文章報道的實驗方法，設計并構建用于編輯瘧原蟲基因組的CRIPSR-cas9重組質粒（PYC質粒）。然后通過電轉、藥物篩選等方式篩選出陽性單克隆重組子孢子。
　　1、利用CRISPR/Cas9技術

5、成功構建了PYC/MAGE-A3重組質粒
　　根據(jù)PYC質粒以及P.b ANKA株UIS3基因序列特點，設計并合成sgRNA序列，隨后通過退火成功連接至PYC質粒BsmBI位點上。然后從P.b ANKA株基因組中擴增UIS3基因的5'UTR和3'UTR序列，從A549人肺腺癌細胞系中擴增肺癌相關抗原MAGE-A3序列，隨后將三個片段通過重疊PCR、無縫克隆等方式插入到PYC質粒的多克隆位點上。最后酶切及測序結果顯示所有片段均插入到

6、正確位置，并未發(fā)現(xiàn)堿基突變。
　　2、通過電轉、藥物篩選等方式成功獲得GAS/MAGE-A3重組減毒子孢子
　　將P.b ANKA株瘧原蟲和構建的PYC質粒混合電轉后通過尾靜脈注射至小鼠體內，24h后開始用8ug/mL乙胺嘧啶溶液進行藥物篩選，持續(xù)給藥至原蟲血癥重新出現(xiàn)，開始進行單克隆篩選，按照每只小鼠接種1條瘧原蟲稀釋接種，接種后第六天開始出現(xiàn)原蟲血癥，30只小鼠中共7只出現(xiàn)原蟲血癥，對出現(xiàn)原蟲血癥的單克隆小鼠提取的gDN

7、A進行PCR以及測序鑒定，結果顯示其中1只為電轉成功的陽性單克隆瘧原蟲。
　　3.GAS/MAGE-A3重組減毒子孢子成功的轉錄并翻譯MAGE-A3重組蛋白
　　為了驗證轉基因瘧原蟲是否能夠轉錄并翻譯肺癌抗原MAGE-A3，我們提取了重組瘧原蟲子孢子RNA，然后將其進行逆轉錄的cDNA進行擴增，成功擴增出MAGE-A3序列的950bp的條帶，說明GAS/MAGE-A3子孢子中的MAGE-A3基因成功轉錄。然后將分離純化的重組

8、瘧原蟲子孢子入侵HepG2細胞，24h后采用間接免疫熒光對HepG2細胞中MAGE-A3蛋白的表達進行觀察。
　　結果發(fā)現(xiàn)轉基因瘧原蟲子孢子納蟲空泡中出現(xiàn)MAGE-A3蛋白，而野生型瘧原蟲卻不表達MAGE-A3蛋白，說明GAS/MAGE-A3子孢子中的MAGE-A3基因成功表達。
　　二、表達MAGE-A3的瘧原蟲減毒子孢子抗肺癌免疫效果及機制研究
　　為了探討表達肺癌相關抗原MAGE-A3的重組遺傳減毒子孢子能否誘導

9、小鼠CD4+/CD8+T細胞應答，以達到抗肺癌作用。本實驗用PBS、GAS、GAS/MAGE-A3分別多次尾靜脈注射免疫HLA-A2小鼠，末次免疫后7天分別檢測各組小鼠外周血及脾臟CD4+/CD8+T細胞反應，然后采用Elispot檢測分泌IFN-γ的MAGE-A3特異性CD8+T細胞。然后將分離收集的免疫小鼠脾臟的CD8+T細胞過繼到皮下接種A549的裸鼠體內，觀察其抗肺癌效果。
　　1、GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子

10、成功誘導小鼠CD4+/CD8+T細胞反應
　　小鼠末次免疫后7天，F(xiàn)ACS分別檢測外周血及其脾臟的CD4+/CD8+T細胞頻率，結果顯示相較于PBS組，GAS/MAGE-A3組和GAS組都能明顯誘導外周血及其脾臟的CD4+/CD8+T細胞應答，且CD8+T細胞活化更加明顯。然后分離收集脾臟CD8+T細胞進行Elispot檢測MAGE-A3特異性CD8+T細胞，結果顯示GAS/MAGE-A3組明顯活化了MAGE-A3特異性CD8+T

11、細胞，而GAS組和PBS組均未發(fā)現(xiàn)。
　　2、GAS/MAGE-A3重組子孢子誘導的CD8+T細胞具有顯著抗肺癌的作用
　　為了探討GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子誘導的CD8+T細胞是否具有抗肺癌的作用，在末次免疫后7天分離收集小鼠脾臟的CD8+T細胞，然后過繼到已經(jīng)皮下接種A549細胞的裸鼠體內，按照5×106/只，每1周一次，共注射三次，觀察是否具有抑制A549皮下瘤的增殖，達到抗肺癌的效果。
　　結果發(fā)

12、現(xiàn)，GAS/MAGE-A3組能夠有效抑制A549皮下瘤的增殖，并明顯延長小鼠的生存期，這說明MAGE-A3特異性的CD8+T細胞在抑制A549增殖起到主要作用。
　　3.GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子通過抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡以及抑制血管生成誘導抗腫瘤效應
　　腫瘤生長60天后，取出腫瘤并用多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后，用Ki-67抗體、Tunel凋亡檢測試劑盒、CD31抗體，分別檢測腫瘤的增殖、凋亡及血管生

13、成情況。
　　結果發(fā)現(xiàn)GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子顯著抑制了腫瘤的增殖及血管生成，促進了腫瘤細胞的凋亡。
　　綜上所述，相比于傳統(tǒng)的基因編輯技術，CRISPR/Cas9技術在瘧原蟲基因編輯上表現(xiàn)出高效、簡便等優(yōu)勢。GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子不僅可以有效誘導CD4+/CD8+T細胞反應，還可以活化MAGE-A3特異性CD8+T細胞。GAS/MAGE-A3誘導的CD8+T細胞可以有效抑制A549細胞的增