約氏瘧原蟲Pys48核酸疫苗的構建及免疫效應觀察.pdf

1、目的: 瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最嚴重的寄生原蟲感染性疾病。據(jù)WHO最新報告顯示，全世界約33億的人口生活在瘧疾風險區(qū)，每年近200多萬人因其死亡。盡管基于化療藥物為主的抗瘧治療對降低瘧疾的病死率取得了顯著成效，但由于耐藥原蟲和殺蟲劑性蚊的出現(xiàn)，單純的化療藥物已經(jīng)不能有效地遏制瘧疾的流行。因此，開發(fā)新型有效抗瘧疫苗成為目前瘧疾防治亟待解決的重點課題。 基于切斷瘧原蟲在人與媒介昆蟲蚊之間傳播的傳播阻斷疫苗(Tr

2、ansmission Blocking Vaccine，TBV)逐漸受到關注。TBV的原理是以有性階段蟲體特異表達的表面靶蛋白作為抗原免疫人體，使之產(chǎn)生抗有性階段蟲體表面蛋白的特異性抗體，從而導致有性階段瘧原蟲的進一步發(fā)育障礙，阻斷瘧原蟲的傳播途徑。與瘧疾感染阻斷疫苗和發(fā)病阻斷疫苗相比，其優(yōu)點為：靶蟲體明顯少于紅內(nèi)期原蟲數(shù)目；作為疫苗研制障礙的抗原變異少見；通過與藥物或其它瘧疾疫苗的聯(lián)合應用可防止耐藥性原蟲的擴散。更重要的是，從群體角度

3、出發(fā)，個體接種疫苗后，受益的將是整個流行區(qū)內(nèi)的人群。因此，有效的TBV的研制開發(fā)必將帶來明顯的社會效益和經(jīng)濟效益。 迄今，關于瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原的研究主要集中于蚊階段蟲體表達的特異性蛋白。P48蛋白是表達于瘧原蟲有性階段配子體和配子表面的主要蛋白。近年來，在對惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum，p.falciparum)流行區(qū)感染患者研究中發(fā)現(xiàn)，由于配子體攜帶者血清中存在具有傳播阻斷活性的抗Pfs48表

4、位抗體，其免疫血清在蚊膜喂養(yǎng)實驗中能夠明顯降低配子體向蚊階段發(fā)育的活性。基因克隆及測序結果顯示，Pfs48在雄性配子受精過程中高度保守，基因多態(tài)性明顯少于其他紅前期和紅內(nèi)期候選抗原。同時研究發(fā)現(xiàn)P48具有半胱氨酸保守行富集序列，高效價的抗體的應答依賴于蛋白表位空間構象的正確折疊。 確定疫苗的免疫活性是評價疫苗有效性的前提。核酸疫苗(又稱DNA疫苗)能夠在宿主體內(nèi)表達具有構象結構的抗原，誘發(fā)機體產(chǎn)生全面的免疫應答，其作為新型疫苗開

5、發(fā)策略已廣泛應用。目前核酸疫苗已經(jīng)成功用于瘧疾紅內(nèi)及紅前期候選抗原的研究，以瘧原蟲紅內(nèi)及紅前期表面抗原構建的核酸疫苗能夠誘導宿主高水平的細胞和體液免疫。 本研究通過構建約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL，p.yoelii17XL) Pys48核酸疫苗，免疫實驗動物小鼠，動態(tài)觀察其免疫活性及傳播阻斷效應，旨在為有效抗瘧疫苗的研制開發(fā)提供新的理論和實驗依據(jù)。 實驗方法: 1、基因組DNA的提取及核酸

6、疫苗的構建 提取p.yoelii17XL基因組DNA，PCR擴增Pys48全基因序列，將該片段插入克隆載體pMD19-T simple，測序鑒定?；厥詹⒓兓p酶切產(chǎn)物亞克隆入真核表達載體pcDNA3.1+，轉化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆。大量擴增陽性重組子，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑獲得核酸質(zhì)粒，此即為載有Pys48目的基因的核酸疫苗。 2、Pys48核酸疫苗的酶切鑒定 LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性重組子過夜，少量提

7、取核酸質(zhì)粒，進行單、雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測。 3、實驗動物免疫及血清采集 將溶于PBS的DV/Pys48，接種于BALB/c小鼠左右大腿肌肉，初次免疫后4w和8w，以等量DV/Pys48兩次加強免疫，每次100μg/只。同時設置空質(zhì)粒和PBS對照組(每組5只)。每次免疫前1—3d尾尖采集各實驗組小鼠血液，分離血清，—80℃保存。 4、血清特異性抗體檢測 以溶有配子體抗原(200ng/孔)的碳酸鹽緩沖液

8、包被96孔酶標板，4℃過夜；用含1％BSA的PBS封閉1h，以TBS緩沖液1：200稀釋免疫后不同時間的小鼠血清，每孔加100μl，室溫孵育2h，加1：5000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG+IgM抗體孵育1h，加入底物溶液顯色，酶標儀檢測492nm處的OD值。 5、免疫印跡和免疫熒光實驗 (1)瘧原蟲抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉移PVDF，5％脫脂奶粉的PBS封閉，與血清(1：50稀釋)孵育4℃過夜。TBST洗滌

9、后，膜與HRP標記的羊抗鼠IgG+IgM(1：5000)共同孵育2h。TBST洗滌后ECL顯影觀察。 (2) PBS稀釋梯度離心分離的配子體，涂布熒光片，冷丙酮固定。用含5％脫脂奶粉的PBS封閉，洗滌，加入抗血清(1:100稀釋)，37℃孵育60min，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG+IgM血清中反應30 min，DAPI染色，封片，熒光顯微鏡觀察。 6、傳播阻斷效應觀察 心臟采集感染后第3天小鼠血液(肝素抗凝)，分

10、裝于1.5ml離心管中，10μl/管，離心，去上清。加入含不同濃度免疫血清的動合子培養(yǎng)液，100μl/管。24℃培養(yǎng)24h后，PBS清洗兩次，取1μl懸液涂于熒光載玻片上，冷丙酮固定。用含5％脫脂奶粉的PBS37℃封閉30min。加入抗合子動合子表面蛋白Pys25 McAbs(1：200)，清洗后加入FITC標記的羊抗鼠IgG+IgM熒光二抗，孵育30min，封片，熒光顯微鏡計數(shù)合子和動合子的形成數(shù)量。 實驗結果: 1、

11、目的基因插入克隆載體及測序鑒定 測序結果顯示插入的目的基因序列與GenBank中Pys48的預測序列相同，酶切鑒定顯示目的條帶與Pys48片段大小一致。 2、Pys48核酸疫苗血清特異性抗體水平變化 于初次免疫后4周，疫苗免疫組小鼠血清特異性抗體水平開始出現(xiàn)有意義的升高。兩次加強免疫后抗體一直維持于較高水平，尤其是末次免疫后，血清抗體效價高達5000，與正常對照組和空質(zhì)粒組相比差異顯著(P<0.01)。

12、3、特異性抗體對天然抗原的識別 免疫印跡雜交實驗顯示，Pys48核酸疫苗誘導的小鼠血清抗體能夠特異性識別天然配子體抗原，免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)特異性蛋白位于配子體表面。 4、傳播阻斷效應觀察 與對照組相比，Pys48核酸疫苗誘導的特異性抗血清對合子和動合子形成具有明顯的抑制作用，其中1：3倍稀釋抗血清的阻斷作用較1：9倍稀釋的抗血清更為顯著。 結論: 成功構建了Pys48核酸疫苗，接種BALB/c小鼠顯