表達(dá)APEC Ⅰ型菌毛的減毒雞傷寒沙門菌重組疫苗的構(gòu)建及免疫保護(hù)研究.pdf

1、雞大腸桿菌病(Chicken Colibacillosis)是由禽致病性大腸桿菌（avian pathogenicEscherichia coli，APEC）引起的雞體局部或全身性感染的傳染病，是造成養(yǎng)禽業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的主要傳染病之一。目前，抗菌藥物仍是防治雞大腸桿菌病的主要措施，由此帶來的生物安全問題受到廣泛關(guān)注。針對(duì)雞大腸桿菌病的防控，采取疫苗預(yù)防與合理用藥相結(jié)合的綜合措施是最為行之有效的方法。因此，開發(fā)強(qiáng)免疫效力且具有廣譜保護(hù)性的

2、新型APEC基因工程疫苗是解決該現(xiàn)狀的一種有效途徑。本研究選擇減毒雞傷寒沙門氏菌SG9R株為宿主菌，以asd基因?yàn)闋I養(yǎng)缺陷標(biāo)志構(gòu)建減毒雞傷寒沙門氏菌染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)表達(dá)禽源大腸桿菌Ⅰ型菌毛抗原，以探討該重組口服疫苗對(duì)預(yù)防雞大腸桿菌病的保護(hù)效果。
　　1.禽源大腸桿菌Ⅰ型菌毛操縱子fim基因的克隆、表達(dá)及生物活性
　　以禽源大腸桿菌分離株CE2基因組DNA為模板，采用長PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼Ⅰ型菌毛操縱子fim基因，克隆

3、至表達(dá)質(zhì)粒載體pBR322，構(gòu)建和篩選出含fim完整基因并正確插入的pBR322-fim重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至無菌毛的宿主大腸桿菌SE5000。該表達(dá)重組菌能分別與雞紅細(xì)胞、酵母細(xì)胞發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)且均能被D-甘露糖所抑制;重組菌與鼠抗Ⅰ型菌毛亞單位蛋白FimA高免血清產(chǎn)生明顯的凝集反應(yīng)。電鏡觀察到重組菌表面長滿菌毛，利用該重組菌免疫小鼠制備抗血清經(jīng)交叉吸附純化后獲得Ⅰ型菌毛單因子血清，可有效用于禽源大腸桿菌Ⅰ型菌毛表達(dá)的檢測。

4、用重組菌pfim進(jìn)行人肺腺上皮細(xì)胞A549體外粘附試驗(yàn)和粘附抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明:重組菌pfim和野生株CE2均具有粘附肺腺上皮細(xì)胞的能力，且重組菌的粘附特性明顯強(qiáng)于野生菌株，而D-甘露糖能有效地抑制上述重組菌或野生菌株對(duì)人肺腺上皮細(xì)胞的粘附結(jié)合。這為開發(fā)以Ⅰ型菌毛作為免疫原的基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　2.禽傷寒沙門氏菌SG9R株asd缺失株平衡致死系統(tǒng)平臺(tái)的構(gòu)建
　　禽傷寒沙門氏菌SG9R弱毒株在預(yù)防禽傷寒中發(fā)揮著

5、較好作用，為將SG9R弱毒株開發(fā)為能攜帶外源基因的口服活疫苗載體且保持其原有免疫原性，利用Red同源重組系統(tǒng)對(duì)SG9R株基因組中編碼天冬氨酸β-半醛脫氫酶的asd基因進(jìn)行敲除，獲得SG9R△asd缺失突變株。該突變株在缺乏外源性DAP培養(yǎng)條件下發(fā)生溶菌死亡，而在添加DAP的培養(yǎng)基或?qū)霐y帶asd基因的互補(bǔ)質(zhì)粒后才能恢復(fù)生長，以此為基礎(chǔ)建立以asd基因?yàn)闋I養(yǎng)缺陷標(biāo)志的禽傷寒沙門氏菌染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)。選擇表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)基

6、因作為報(bào)告基因，以攜帶鏈球菌asd基因的pYA3342質(zhì)粒為表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白的重組菌SG9R（pYA3342-GFP）。該重組菌在體外傳至40代后，經(jīng)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析表明仍可穩(wěn)定高效表達(dá)綠色熒光蛋白;同時(shí)，將該重組菌口服接種20日齡仔雞，發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于雞的脾臟、肝臟及腸道組織等，體內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)表明重組菌可在雞體內(nèi)停留2-3周。以上結(jié)果表明該缺失株可以用來作為宿主載體平衡致死系統(tǒng)來高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因，為弱

7、毒禽傷寒沙門氏菌作為載體的基因工程活疫苗研制提供了優(yōu)良的操作平臺(tái)。
　　3.禽源大腸桿菌Ⅰ型菌毛抗原在雞傷寒沙門氏菌SG9R△asd缺失株中的表達(dá)及免疫保護(hù)效果研究
　　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出禽源大腸桿菌表達(dá)Ⅰ型菌毛的fim操縱子基因并將其克隆至攜帶asd基因的組成型表達(dá)載體pYA3342，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3342-fim，重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化至減毒雞傷寒沙門氏菌SG9R△asd缺失株，普通LB平板篩選陽性克隆，命名為SG9

8、R(pYA3342-fim)。經(jīng)甘露糖敏感性血凝試驗(yàn)與抗甘露糖血凝試驗(yàn)、酵母細(xì)胞凝集試驗(yàn)表明重組菌在普通培養(yǎng)條件下（37℃，振蕩培養(yǎng)）能夠很好的表達(dá)Ⅰ型菌毛。同時(shí)，對(duì)重組疫苗的生長特性、遺傳穩(wěn)定性及口服安全性等生物學(xué)特性進(jìn)行了評(píng)定。通過對(duì)3周齡非免疫雞口服接種重組菌苗SG9R（pYA3342-fim）作為免疫組， SG9R(pYA3342)為空載體對(duì)照組，PBS為空白組，分別對(duì)各組試驗(yàn)雞于不同時(shí)間段采集血清利用間接ELISA法測定抗Ⅰ型

9、菌毛特異性IgG抗體動(dòng)態(tài)水平，一次免疫14d后，免疫組血清抗體水平顯著高于空載體對(duì)照組和空白組(P＜0.05)，而空載體對(duì)照組與空白組之間無顯著性差異(P＞0.05);在整個(gè)免疫周期內(nèi)（4周），免疫組雞血清中特異性抗體水平均呈上升趨勢。用禽致病性大腸桿菌強(qiáng)毒株QD2對(duì)各試驗(yàn)組雞群經(jīng)后胸氣囊攻毒，實(shí)驗(yàn)觀察10d內(nèi)，免疫組、空載體對(duì)照組及空白對(duì)照組的死亡率分別為40.0％、73.3％、80.0％。試驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建重組活菌苗SG9R(